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Behavior

Variantes de agua poco profundos (para niños) de las pruebas de laberinto de agua en ratones

doi: 10.3791/2608 Published: June 3, 2013

Summary

Ratones

Abstract

Cuando Richard Morris diseñó su laberinto de agua en 1981 7, la mayoría del trabajo conductual se realizó en ratas. Sin embargo, el mayor conocimiento de la genética del ratón provocó el ratón cada vez más importante. Sin embargo, los investigadores encontraron que algunas cepas de ratones mutantes eran propensos a problemas como pasivamente flotante o buceo cuando se probaron en el laberinto de agua de Morris 11. Esto fue sorprendente, teniendo en cuenta su hábitat natural; ratas nadan naturalmente (clásicamente, la "rata de alcantarilla"), mientras que los ratones desarrollaron en las zonas secas de Asia central.

Para superar estos problemas, se consideró si el agua poco profunda sería un estímulo suficiente para proporcionar de escape motivación para los ratones. Esto también evitar los problemas de secado de las pequeñas criaturas con una toalla y luego poniéndolas en una cámara de recuperación caliente para evitar la hipotermia, que es un problema mucho más grave que con ratas; la gran relación de área superficial a volumen de un ratón hace que particularly vulnerables a una rápida pérdida de calor.

Otra consideración es si una estrategia de escape más natural podría ser utilizado para facilitar el aprendizaje. Dado que los animales que caen en el agua y nadar lejos de la seguridad de la costa es poco probable que transmitir sus genes, los animales han desarrollado una tendencia natural a nadar a la orilla de un cuerpo de agua. El laberinto de agua de Morris, sin embargo, les obliga a nadar a una plataforma oculta hacia el centro del laberinto - exactamente opuesta a su comportamiento evolucionado. Por lo tanto el laberinto infantil debe incorporar de escape hasta el borde del aparato. Esta característica, junto con el uso de relativamente no aversivo aguas poco profundas, encarna el aspecto de "refinamiento" de las "3 erres" de Russell y Burch 8.

Se probaron varios tipos de diseño del laberinto, la característica común es que el agua siempre fue poco profundo (2 cm de profundidad) y el escape fue a través de un tubo de perforación de la pared transparente del aparato. Otros tubos ("falsa salidas ") también se coloca alrededor de las paredes, pero éstos estaban bloqueadas. Desde el interior del laberinto todas las salidas falsas y la única salida verdadera tenía el mismo aspecto. Actualmente un laberinto dodecagonal (12 lados) está en uso en Oxford, con 12 salidas de verdadero / falso situados en las esquinas. En un reciente desarrollo de un remo del laberinto transparente ha sido probado con éxito.

Introduction

Los laberintos de Morris y Barnes

Desde los inicios de la psicología experimental, los estudios sobre aprendizaje animal se han basado en gran medida en los laberintos, generalmente construidas de madera o de metal opaco. Inevitablemente, debido a las capacidades olfativas extraordinarias de roedores, muchos de los estudios que utilizan ellos estaban comprometidos hasta cierto punto, cuando el experimentador cree que él / ella había tenido éxito en la enseñanza de un animal de una discriminación visual o la posición, la rata o el ratón en realidad habían sido principalmente usando olfato para resolver el problema. Esto se resume en la controversia sobre si las ratas con lesiones del hipocampo pueden realizar tareas de memoria de referencia espacial, que se analizan en detalle en 2002 4. Esencialmente, David Olton y sus colegas, además de en los primeros trabajos con el laberinto radial, no parecen tener siempre gira sistemáticamente sus laberintos. Esto llevó a los animales lesionados hipocampo resolver la tarea, presumiblemente por señales olfativas que hicieron ebrazo ach distintivo. En Oxford, a (natural) del ratón ciego se observó en una ocasión en un laberinto radial de seis brazos. Dejó su brazo de inicio y giró a la derecha. Luego de cruzar el centro y eligió el brazo opuesto. Luego cayó en una estrategia estereotipada de siempre girando a la derecha, pero cuando se encontró de nuevo la base del primer brazo que había entrado, se tomó un momentáneo oler él (~ 0,2 seg), entonces la rechazó y se trasladó a la próxima brazo. Si la información olfativa en una sola visita podría tener en cuenta, es evidente que las pruebas sobre los ensayos repetidos en un laberinto estático con el mismo brazo siempre con cebo llevaría a fuertes asociaciones olfativas con la recompensa, y el aprendizaje se produciría fácilmente, incluso si la lesión impidió cualquier puramente aprendizaje espacial.

Problemas como estos son el estímulo para el desarrollo de su Morris laberinto de agua 7, el agua no proporcionaría constantes señales olfativas localizadas.

La piscina infantil es esencialmente un híbrido entre la tradiciónlaberinto de agua internacional diseñado por Morris 7 y la seca Barnes 1 laberinto. En el laberinto de agua de Morris, los animal nada en aguas profundas, escapan de la que es el agua poco profunda que cubre una plataforma sumergida situada ligeramente hacia el centro del laberinto. En el laberinto de Barnes, el animal se coloca sobre una plataforma circular (seco) con orificios de salida alrededor de la periferia, sólo uno de los cuales ofrece escape a una caja colocada debajo.

El uso de remar como un escape motivación surgió de problemas cuando se informó un número desproporcionado de algunas cepas de ratones transgénicos que no pudieron nadar correctamente en el laberinto de Morris. O bien han buceado o pasivamente flotaban 11. Dado que esto podría representar una respuesta relacionada con el estrés, se razonó que la reducción del agua a la profundidad remar puede ser suficiente para superar este problema, que de hecho lo hizo. También se decidió para permitir el escape a un tubo seco situado en el lado del aparato, en lugar de con el agua poco profunda que cubre una plataforma. Estesería una respuesta de escape más "natural", y aumentar el componente espacial de la prueba, ya que una gran parte del aprendizaje inicial en el laberinto de Morris es de procedimiento, los animales deben primero superar su tendencia innata a nadar a lo largo de las paredes del laberinto antes de aprendizaje espacial puede comenzar.

El laberinto de Barnes también puede sufrir de los animales no están lo suficientemente motivados para escapar de la plataforma circular de 10,11.

Protocol

1. Las piscinas infantiles Oxford

La piscina infantil se ha realizado de acuerdo con tres diseños sucesivos, Mc 1-3. Todos emplear aguas poco profundas (2 cm) contenidos en una base blanca (para aumentar su aversión), que está rodeado por paredes transparentes hechas de plexiglás o plástico acrílico transparente. Estos tienen salidas de verdadero / falso establecidos en ellos. Los falsos salidas están ocluidos por los tapones negros de madera pintados, mientras que la verdadera salida es abierta y se unió a un tubo de plástico negro que se puede quitar con el ratón en el interior. El ratón se regresó con rapidez y de forma no traumática a su jaula, mientras que en el interior del tubo. Después de la primera publicación de la piscina infantil, se informó de que el regreso a la jaula era también un motivador efectivo para el aprendizaje del laberinto Lashley III 2.

La temperatura del agua de 20 a 25 ° C se utiliza. 20 a 21 ° C es ideal, se ha observado que algunos ratones parecen menos motivados a temperaturas más altas.

contenido "> El primer laberinto 5 era circular. Sin embargo, a veces los ratones (en particular los que tienen lesiones en el hipocampo) parecen no notar el tubo de salida abierta. Un diseño octogonal, con los tubos de salida colocados en las esquinas con el fin de atraer la atención de los ratones, mejorado en gran medida este problema. Sin embargo, la tasa de error en el funcionamiento oportunidad sería 4/trial, en oposición a 6/trial con el diseño circular 12 de tubo. Por lo tanto una piscina dodecagonal se utiliza ahora con 11 falsa y 1 verdadera salida situado en los ángulos formados por las intersecciones de las paredes.

1.1. Evolución y características de las piscinas para niños

Mc 1, una piscina circular de 85 cm de diámetro con 12 salidas de verdadero / falso (Figura 1).

Mc 2, una piscina octogonal de 86 cm de diámetro con 8 salidas de verdadero / falso establecidos en las esquinas.

Mc 3, una piscina dodecagonal (12 lados) 120 cm de diámetro con 12 verdadero / falso salida establecidos en el maízres (Figura 4).

En todo lo anterior (y el laberinto infantil, véase más adelante) de los tubos de salida fue de 40 mm de diámetro. Sin embargo, se dio cuenta de que de vez en cuando a los ratones se mostraban reacios a entrar en ellos, y el rendimiento de control en el laberinto a veces sumergir después de haber estado respondiendo bien. Por lo tanto, y teniendo en cuenta la facilidad con que entraron en el aparato de madriguera (ver publicación JOVE "Evaluación de madriguera, la construcción del nido y el acaparamiento en ratones"), además de que los orificios de salida en el laberinto de Barnes son de 50 mm de diámetro, se consideró si el 40 mm era demasiado pequeña. Una prueba se llevó a cabo en la jaula de alojamiento de seis ratones C57BL / 6. (Se parecen más dispuestos a entrar en 40 tubos mm en la jaula como presumiblemente el estrés es menor aquí que en una pieza del aparato, por lo que hace el examen de la jaula reduciría al mínimo las diferencias de entrada si los tubos más pequeños fueron ligeramente aversivo, haciendo que la probar más conservador). Dos tubos de 40 mm y dos tubos de 50 mm se colocaron en el suelo en unmodelo de alternancia. Como se predijo, hubo más entradas en tubos de 50 mm (28 entradas) de 40 mm (9 entradas). Por lo tanto se han previsto pruebas piloto en un laberinto Y nueva con tubos de salida de 50 mm, y si esto tiene éxito los viejos tubos de 40 mm en la piscina dodecagonal y remar laberinto Y serán reemplazados por nuevos 50 mm queridos.

A medida que la piscina infantil, infantil del laberinto y la novedad espacial del laberinto son todas las pruebas espaciales, basándose en las señales de las habitaciones que el ratón ve a través de las paredes transparentes del aparato, la habitación debe estar bien amueblada con señales distintivas (por ejemplo, estanterías, armarios, formas de plástico negro en las paredes).

2. Ejecución de la Piscina para niños

  1. Coloque un ratón en el centro de la piscina frente a una de cuatro posiciones en el perímetro (9, 12 o tres si el tubo de escape es a las 6 horas). La colocación es semi-aleatoria; un máximo de tres ensayos consecutivos, puede ser en la misma dirección. Esto puede ser difícil de lograr en la práctica, porque comoaprendizaje procede de los ratones tienden a orientarse hacia la salida correcta, ya que se bajan a la piscina por la cola. Si lo hacen fuerte no debe hacerse ningún intento de forzarlos en la posición prevista, ya que son simplemente demostrando aprendizaje.
  2. Suelte cuando están justo por encima del agua, como entonces se les cae y al instante saben que ya no están detenidos. Poco a poco la liberación de los resultados de los que luchan por liberarse y esto puede poner en peligro la orientación inicial. Esto también se aplica a el laberinto infantil.
  3. Longitud máxima del ensayo es de 60 seg. Si el ratón no puede escapar de ese entonces, guiar manualmente a la salida con un par de palas de metacrilato transparentes, cada una mide aproximadamente 30 x 20 cm. Las medidas adoptadas son el tiempo para encontrar la salida (definición: toda la cabeza dentro del tubo) y los errores. Los errores se definen como que no superen la longitud de la cabeza de un tubo (incluida la salida real). Al pasar cerca de la salida real, sin entrada, por lo general me ocurrenfrequently después de los primeros ensayos. Aunque se puede argumentar que este es un problema, una visión alternativa es que los ratones con deficiencias en la cognición espacial hacen esto porque no saben que hay una salida por allí. Controles saben, y por lo tanto investigar más a fondo. Un techo de errores 11 / ensayo se impone en el número de errores en el análisis, para evitar demasiado corte de los datos. Esto mitigar frente a un déficit que se encuentra en ratones espacialmente con discapacidad, es decir, es una medida conservadora. Los ratones que no logran llegar a la salida en 60 segundos se les asigna una puntuación de 11 errores de ese juicio. Así que 60 veces 11 seg siempre tienen errores.

3. El Remando del laberinto

Para simplificar el procedimiento de piscina infantil y el aparato se decidió experimentar con un laberinto Y, operado de acuerdo con los mismos principios que las piscinas infantiles. El aparato consiste en tres brazos de poliestireno transparente o de plexiglás, cada 30x 8 x 20 cm. Este está montado sobre una base blanca (Figura 7). Blanco fue elegido para maximizar la repulsión que causa el color del piso y así alentar a escapar de las aguas poco profundas (2 cm de profundidad). Al igual que en el laberinto de agua, sólo hay una salida verdadera, con los otros dos brazos que termina en salidas falsas que tienen el mismo aspecto desde el interior del laberinto (Figura 8).

Ejecución del remo del laberinto

Coloque un ratón en el extremo de uno de los brazos cerrados, de espaldas a la central. La secuencia de las armas elegidas como la posición inicial se define por una secuencia semi-aleatoria, no más de tres ensayos consecutivos con la misma posición, y un número igual de los brazos izquierdo o derecho. Cada prueba dura 60 segundos. Si el ratón no puede salir (toda la cabeza en el tubo de salida) dentro de este tiempo alentar a que entre en el brazo con la ayuda de una pieza de metacrilato transparente. La base del brazo de salida está bloqueada por el metacrilato y el ratón permitido encuentra a la salida por sí mismo; estedeberían alentar un mejor aprendizaje de empujar las cosas bien en el tubo. Pero esto puede ser necesario recurrir a si el ratón se resiste a entrar en el tubo después de 15 seg. Tome medidas del tiempo total para salir y el número de errores (todo el cuerpo excepto la cola entra en un brazo a ciegas).

Calificación del remo del laberinto

Hay dos definiciones de un juicio correcto: en primer lugar, uno en el que el ratón se encuentra en la salida de <60 seg y no hace entradas en los brazos ciegos, con errores se anotó si se introducen y / o brazos ciegos si la salida no se encuentra dentro de 60 seg. Este análisis confunde fracasos para comenzar a moverse con errores en entradas en los brazos. En segundo lugar, un análisis de los ensayos que hace hincapié en la capacidad cognitiva se puede realizar mediante la exclusión, por cada ratón, todos los ensayos en los que el ratón no salió del brazo de partida dentro de los 60 segundos (es decir, eliminar los 0 puntuaciones 60) y luego calcular el% correcto del restantes ensayos.

4. Dos tipos de Y-laberintoConjunto

1. Aparato

Cuando se construye un laberinto Y para niños, es útil incorporar dos puertas para permitir que se ejecute como un (seco) espacial novedad experimento de memoria 6 (Figura 13). Una puerta de guillotina transparente cubre el orificio de salida en la pared de extremo del brazo de salida, mientras que una puerta de guillotina opaca se puede insertar para sellar de un brazo de los otros dos durante la fase de muestreo de la prueba. Es importante que los corredores de estas puertas no están al alcance de los ratones, ya que de lo contrario pueden desviar su atención porque están potenciales rutas de escape. Lo ideal es que deben extenderse 7 cm hacia abajo desde la parte superior de la pared del laberinto.

2. Puesta en marcha

Coloque una (0,5 cm) de la capa delgada de madera material de cama de chips en el suelo de el laberinto. Esto se redistribuye entre las dos fases de prueba para ratones individuales, y entre los ratones. Para las mejores prácticas, para hacer el ambiente olfativo more similar para los primeros frente a los ratones posterior, coloque uno o dos ratones no experimentales en el laberinto durante unos minutos antes de que comience el experimento.

3. Procedimiento

Con el brazo de salida bloqueada por la puerta opaca y su orificio de salida bloqueada por la puerta transparente, coloque el puntero del ratón en el grupo de inicio (uno de los dos brazos sin salir del laberinto) y deje que explore durante 5 min. A continuación, eliminarlo, levantar la puerta opaca para permitir el acceso a las tres armas, reemplazarlo en el grupo de inicio y observarlo durante 2 min. Anote el número de entradas y el tiempo pasado en cada brazo. Los ratones de control deben recordar que las primeras dos brazos, y pasar más tiempo en el brazo antes eran inaccesibles.

Representative Results

Lesiones del hipocampo afectan en gran medida el aprendizaje en la piscina infantil 5. El uso de un laberinto Y para niños, un déficit dependiente de la edad se ha demostrado en 10 y 14, pero no 3 meses de edad ratones Tg2576 (un modelo de amiloide sobre-expresión). Control de ratones Edad (21 meses) también obtuvieron malos 3. Un experimento de la memoria espacial novedad correr en el laberinto seco reveló deficiencias en los ratones knockout con el receptor-A (GluR-A) subunidades del receptor de glutamato AMPA 9.

Figura 1
Figura 1. Un ratón en el Mk 1 piscina infantil circular.

La figura 2
Figura 2. El ratón encuentra el tubo de salida de la piscina infantil.

Figura 3 "src =" / files/ftp_upload/2608/2608fig3.jpg "/>
Figura 3. El ratón escape en el tubo de salida. El tubo es entonces separado del laberinto y el ratón volvió a su jaula.

Figura 4
Figura 4. Un ratón en la piscina infantil dodecagonal.

La Figura 5
Figura 5. Un ratón a punto de cometer un error, ya que se acerca a una salida falsa.

La figura 6
Figura 6. Un error se comete como la nariz del ratón viene dentro de la distancia de la cabeza de una salida falsa. La salida real es a su derecha, con el tubo de salida conectado.


Figura 7. A remar Y-laberinto.

La Figura 8
Figura 8. Detalle del extremo del brazo de salida de la Y-laberinto. Un canal en forma de U poco profunda colinda con el orificio de salida en la pared de extremo. Esto apoya el tubo de salida, que se muestra por debajo del soporte en la imagen de arriba. El tubo de salida puede ser retirado del soporte para tomar el ratón de nuevo a su jaula de alojamiento. Todos los brazos están equipados con esta pared extrema del brazo de configuración, pero sólo tiene un corte agujero circular en ella para permitir el escape.

Figura 9
Figura 9. Un ratón en un callejón sin salida del laberinto Y remando.

Figura 10 Figura 10. El ratón encuentra el tubo de salida.

Figura 11
Figura 11. Un ratón, después de haber escapado de el laberinto para niños, espera a ser devuelto a su jaula.

Figura 12
Figura 12. Ratones general, se puede confiar en ellos para permanecer en el tubo mientras se llevan de vuelta a su jaula cerca.

Figura 13
Figura 13. La combinación de un laberinto Y remando con una configuración del laberinto novedad espacial. Una puerta de guillotina opaca se inserta en una diapositiva en el extremo proximal de un brazo, y una guillotina transparentesellos de la puerta fuera del orificio de salida.

Discussion

En conclusión, parece remar un motivador generalmente eficaz para los ratones, y evita el estrés asociado con la natación en aguas profundas. A diferencia de las medidas de tiempo de escape en el laberinto de agua de Morris y la longitud de la trayectoria, la tasa de error en la piscina infantil para los ratones lesionados del hipocampo se mantuvo constante durante todo el período de formación 5, por lo que este representa una medida pura de la memoria espacial, en oposición a escapar de tiempo o la ruta longitud, que tanto disminuyen a medida que los ratones se familiaricen con los elementos no-espaciales de la tarea. La medida de errores también proporciona una mayor magnitud de la diferencia entre los ratones y los controles deteriorados (por ejemplo, hipocampo lesionado).

En la publicación original, se realizaron pruebas de la sonda para comprobar si los ratones estaban realmente utilizando señales espaciales 5. En la sonda 1, el laberinto se hizo girar 120 °, pero la ubicación geográfica del tubo de escape sigue siendo el mismo que en la formación. Rendimiento se mantuvo prácticamente sin cambios. En la sonda 2, similar a la prueba de extinción estándar en el laberinto de Morris, el tubo de salida estaba bloqueada. El tiempo empleado en el cuadrante de entrenamiento del laberinto, donde se encontraba anteriormente el tubo de salida, fue de 50% para los ratones de control, 25% para los ratones con lesiones del hipocampo. En una tercera prueba de la sonda en la que se cambió la posición del tubo de salida, los controles de nuevo pasaron más tiempo en el cuadrante de la formación inicial. Estas pruebas sonda confirmaron que los ratones no estaban usando señales intramaze pero fueron guiados por las señales espaciales en el laboratorio externo para el laberinto. Esta falta de influencia de las señales intramaze pone a la piscina para niños una ventaja sobre el laberinto de Barnes.

Aunque no hemos probado las ratas en laberintos infantiles, esto podría ser posible, aunque podría ser una ventaja para que el agua más fría que el 20 a 25 ° C se utiliza normalmente en el laberinto de Morris. Sin embargo, ya que sus cuerpos no se sumergen en el agua esto no debería tener efectos adversos bienestar.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

El Wellcome Trust para proporcionar financiación de Acceso Abierto a la Universidad de Oxford. Robert Diácono es un miembro del grupo OXION Oxford, financiado por el Wellcome Trust subvención WT084655MA.

References

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Deacon, R. M. J. Shallow Water (Paddling) Variants of Water Maze Tests in Mice. J. Vis. Exp. (76), e2608, doi:10.3791/2608 (2013).More

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