Medición de Coordinación motora en ratones

Summary

Los protocolos se presentan establecidas dos tareas de coordinación motora, la barra de rodillo giratorio horizontal y la aceleración, también dos pruebas desarrolladas en Oxford recientemente, las barras estáticas y barras paralelas. Estas pruebas pueden detectar deficiencias motoras potencialmente de interés en su propio derecho, así como que son posibles variables en las pruebas de otras áreas de la conducta.

Abstract

Los ratones se utilizan cada vez en neurociencia conductual, reemplazando en gran medida las ratas como animales del conductista de elección. Antes de aspectos del comportamiento, tales como la emotividad o la cognición pueden ser evaluados, sin embargo, es vital para determinar si las capacidades motoras, por ejemplo de un ratón mutante o lesionado permiten este tipo de evaluación. El rendimiento en una tarea de laberinto que requiere fuerza y ​​la coordinación, tales como el laberinto de agua de Morris, bien podría verse afectada en un ratón por el motor, en lugar de cognitiva, deterioro, por lo que es esencial para diseccionar selectivamente el último de los primeros. Por ejemplo, sensoriomotora impedimentos causados ​​por se ha demostrado que los antagonistas NMDA perjudicar el rendimiento del laberinto de agua ^2.

La coordinación motora tradicionalmente se ha evaluado en ratones y ratas mediante la prueba de cilindro giratorio, en el que el animal es colocado en una barra horizontal que gira alrededor de su eje largo, el animal debe andar hacia adelante para permanecer en posición vertical y no caerse.Tanto la velocidad establecida y versiones aceleración del rotarod están disponibles.

Los otros tres ensayos descritos en este artículo (barra horizontal, barras estáticas y barras paralelas) toda medida de coordinación en el aparato estático. La barra horizontal también requiere fuerza para un desempeño adecuado, sobre todo de las extremidades anteriores como el ratón inicialmente agarra la barra sólo con las patas delanteras.

Las ratas adultas no se desempeñan bien en las pruebas, como las barras estáticas y barras paralelas (observación personal), aparecen menos coordinadas que los ratones. Sólo he probado las ratas macho, sin embargo, y los ratones machos parecen generalmente menos coordinada y que las hembras. Los ratones parecen tener una mayor resistencia: relación en peso que las ratas; el nombre latino, Mus musculus, parece totalmente apropiado. El rodillo giratorio, las variaciones de la prueba de falta de pie ¹² o el (Noldus) ¹⁵ aparato de pasarela se utiliza generalmente para evaluar la coordinación motora en ratas.

Introduction

El comportamiento se manifiesta en la acción, y la acción requiere de habilidades motoras, incluyendo la coordinación del cuerpo. Uno de los primeros experimentos en la historia del comportamiento de los animales fue realizada por Colin Stewart, estudiante de doctorado en la Universidad de Clark en los EE.UU. ^11. Se midió la actividad de las ratas al ponerlos en un tambor y se contó el número de veces que se dio la vuelta. Este aparato temprana fue probablemente el precursor de funcionamiento de las ruedas y la prueba de rotarod utilizado actualmente, aunque en el aparato de Stewart la rata era el interior del tambor, el movimiento de las cuales fue impulsado por la rata, mientras que en el cilindro giratorio el animal camina sobre la parte exterior de un tambor giratorio o varilla que es accionado por motor.

La varilla original utilizado por Dunham y Miya (1957) ⁷ tenía una velocidad establecida, pero las versiones actualmente aceleración (Jones y Roberts 1968) ⁹ disponibles. La desventaja de un rodillo giratorio de velocidad establecido es que algunos animales con mala coordinación se caen enel principio, mientras que para los que se quedan en la prueba comenzará pronto para medir la resistencia en lugar de la coordinación en sí. La distribución bimodal que resulta de los puntos de datos puede ser suficientemente anormal como para impedir el análisis paramétrico. Cuando se utiliza un rodillo giratorio acelerando, en particular si se acelera sólo cuando se alcanza un criterio de conjunto, tales como permanecer durante 10 seg,, es más probable que sea gaussiana de distribución de datos. La tasa de aceleración puede ser ajustada de modo que la fatiga del motor no juega un papel significativo en el rendimiento, es poco probable que sea marcadamente fatigado después de sólo 2-3 min de tiempo en el rodillo giratorio un ratón.

La "prueba de la cuerda" ¹ ", prueba percha" o la barra horizontal mide la fuerza y la coordinación de la extremidad anterior. Los dos epítetos citados se refieren a su desarrollo, originalmente se utilizaba una cadena, pero los autores señalaron que el rendimiento depende en gran medida de cómo se tensa la cuerda, por lo tanto, los futuros experimentadores utilizaron una barra de metal, a menudo una percha. Hemos encontrado que la capacidad de un ratón para agarrar la barra es inversamente proporcional a su diámetro, y hemos utilizado de forma estándar una barra de 2 mm. En la prueba de pesos (véase el protocolo JoVe "Medición de la fuerza de ratones") el alambre muy fino de un colector de piel / escala hervidor de agua permite que los animales más fuertes para asegurar un buen agarre de tal manera que se pueden levantar más de su propio peso corporal. Sin embargo, el uso de barras horizontales de mayor diámetro puede ser una ventaja ya que la sensibilidad de la prueba mejora; con sólo una barra de 2 mm más normales C57BL / 6 ratones alcanzan el rendimiento techo. Por lo tanto hemos adoptado recientemente un aparato de tres barras, las barras pueden ser fácilmente intercambiados cuando se ajusten en las muescas cortadas en la parte superior de las columnas de soporte. Las barras se mantienen bajo tensión (especialmente importante para hacer que la barra rígida 2 mm), ya que sólo se ajustan a las muescas cuando los soportes están ligeramente extraerse juntos (como un arco largo y su cadena) (véase la Figura 3).

Barras estáticas o vigas a menudo se han utilizadopara medir la coordinación, sino motivación adicional siempre fue utilizado para persuadir a los animales para atravesar la barra. Ellos negocian una viga horizontal para alcanzar una meta deseada, tal como la jaula de alojamiento, refugio de una luz brillante, o alimentos (si se ha hecho hambre). Sin embargo, en el curso de la investigación de este tipo de prueba, he descubierto que los ratones podrían espontáneamente dar la vuelta cuando se coloca en el extremo "abierto" de una barra en voladizo, y luego atravesarlo hasta llegar al extremo soportado. Esta técnica elimina la necesidad de una formación (necesaria en las variantes de prueba mencionados anteriormente) como la reacción innata de un ratón para ser colocado cerca del extremo de una varilla de elevada es tratar de alcanzar el extremo soportado. Esto no significa, por supuesto, eliminar el problema de que los cambios motivacionales pueden afectar al rendimiento, lo cual es siempre una posibilidad de este tipo de procedimiento.

Túneles de cartón son muy utilizados en la actualidad para el hogar enriquecimiento ambiental jaula, pero sus desventajasvista en el contexto actual es que los animales, inevitablemente, se practicarán en equilibrio sobre cilindros que puede tambalearse sobre su eje longitudinal, imitando las habilidades necesarias para mantener el equilibrio sobre el rodillo giratorio. Así enriquecimiento jaula podría enmascarar un fenotipo conductual, un ejemplo es la mejora de la enfermedad de Huntington fenotipo mediante enriquecimiento ^14. También los animales suelen caminar a lo largo del eje longitudinal de estos túneles, ya que al caminar a lo largo de una viga de estática elevada. Por eso construí un par de barras paralelas elevadas, y puse los ratones en el centro con las patas delanteras en una barra y las patas traseras en el otro, una situación que nunca hubieran encontrado antes. Los ratones tenían que llegar a los soportes extremos de las barras paralelas mientras permanece en posición vertical para pasar la prueba. Un dispositivo algo similar era una serie de barras paralelas colocadas en una jaula de ratón para evaluar el desarrollo de la tembladera inducida por disfunción motora ^13.

Hemos probado varios cientos deratones para el funcionamiento motor en Oxford. Estos habían recibido varios tratamientos, incluyendo agentes farmacológicos, o de transferencia pasiva del tejido (plasma) de los seres humanos, pero la mayoría de los animales modificados genéticamente. Algunos animales estaban más deteriorados de la fuerza de tareas de coordinación, otros al revés. Algunos ratones estaban más deteriorados en el rodillo giratorio que en sustratos estáticos, como las barras estáticas y barras paralelas, otros al revés. Así, el presente artículo y el protocolo adjunto Jove "Medición de la fuerza en ratones") describe cómo caracterizar la forma en que diferentes tratamientos y mutaciones pueden afectar diferencialmente la función motora en ratones. Aparte de la varilla giratoria del aparato descrito aquí es sencillo, barato y particularmente adecuado para laboratorios no especializados para probar las habilidades motoras. Para el análisis de la marcha a escala fina, el sistema de pasarela es un sistema mucho más sofisticado que los métodos más antiguos, como convencer a un ratón para caminar a través de un baño de tinta y luego por una hoja de papel, pero es una expensive pedazo de aparato.

Todas estas pruebas están diseñadas para medir la coordinación en lugar de la fuerza, si bien es necesario, simplemente para el ratón a utilizar sus extremidades, obviamente, un mínimo grado de tono muscular. Para la evaluación de la fuerza, el procedimiento pantalla invertida ¹⁰ es más adecuado, o, si se requiere una medición más gradual, la prueba de pesos o su automatizado bar-pull equivalente (descrito en JoVe protocolo de "fuerza de medición en los ratones"). La excepción es la prueba de barra horizontal, que requiere tanto la fuerza y ​​la coordinación para el funcionamiento con éxito.

Protocol

1. Aparato

Para todas las pruebas, una superficie suave rellenado se coloca en la base del aparato para amortiguar los ratones a los que se caen. NB Esto no se muestra en las figuras, a fin de no oscurecer cualquier parte del aparato. Durante las pruebas de cientos de ratones, tanto normal y mutante, que nunca han observado cualquier lesión causada por la caída de dicho aparato, que es típicamente de 30-50 cm de altura. Además, asegúrese de limpiar y esterilizar el equipo entre cada ratón probado.

1.1 rotarod

Hay varias versiones comerciales de este aparato en el mercado, pero algunos tienen desventajas, tales como no para acelerar a una velocidad adecuada para detectar la falta de coordinación motriz (en lugar de la resistencia). Otro fallo común es que la caña no es lo suficientemente alto por encima de la base, lo que resulta en los ratones tienden a caerse o saltar.

El rodillo giratorio se muestra en la Figura 1 se hizo para el diseñodel autor por las secciones de ingeniería del departamento de Farmacología de la Universidad de Oxford. La varilla es de 3 cm de diámetro, con el apoyo 30 cm por encima de la base del aparato. La superficie está moleteada en una serie de crestas paralelas a lo largo del eje longitudinal, lo que permite a los ratones para agarrar de manera efectiva (Figura 2). NB La profundidad de las estrías es un detalle importante: si el ratón no se puede obtener un buen agarre de la prueba será mucho más difícil, por otro lado, si el agarre es muy bueno el ratón "voltereta" en torno a la varilla mediante la celebración de forma pasiva a ella. Para los "fabricantes rotarod aficionados", puede ser útil saber que espigar madera estriada de un tamaño adecuado para ratones está disponible comercialmente, sino que, por supuesto, deben ser tratados con un buen barniz resistente al agua antes de su uso. La velocidad de inicio se ajusta a 4 rpm, la velocidad de aceleración de 20 rpm / min. La velocidad máxima es de 40 rpm.

Dos bridas evitar que el ratón dejando la varilla. Ellos son 30 cm de diámetro (esteprobablemente podría reducirse a 20 cm). Su separación se fija en 6 cm (máximo), pero puede ser necesario ajustar más pequeña para los ratones subadultos si tienden a girar alrededor de la varilla.

1.2 barras horizontales triples (Figura 3)

Las barras están hechas de metal, 38 cm de largo, que se celebró 49 cm por encima de la superficie de la mesa por una columna de soporte de madera en cada extremo. Las columnas están fijadas a una base de madera pesada. Tres diámetros de las barras están disponibles: 2, 4 y 6 mm. La barra de 2 mm es el estándar que utilizamos, pero muchos ratones alcanzan la máxima puntuación en este. Por lo tanto, las barras de mayor diámetro se han incluido en un intento de refinar la prueba, ya que los ratones no pueden agarrar estos tan bien.

1.3 barras estáticas

Cinco clavijas de madera o varillas de espesor variable (35 (barra 1), 28, 22, 15 y 9 (barra 5) mm de diámetro) cada 60 cm de largo se fijan por un G-abrazadera a un estante de laboratorio de tal manera que las varillas sobresalen horizontalmente en el espacio (Figura 4). El finde la barra, cerca de la banca tiene una marca de 10 cm del extremo, para denotar la línea de meta. La altura de las barras por encima del suelo es de 60 cm.

Si se requiere una prueba más corta y menos detallada, utilice sólo los más grandes barras, más pequeños y media. Van Dellen et. Al ¹⁴ utiliza una sola vara para evaluar el progreso de la enfermedad de Huntington en ratones.

1.4 Barras paralelas

Dos barras de acero paralelas 1 m de longitud y 4 mm de diámetro están fijados 30 mm (en sus centros) de separación por columnas de soporte de madera en sus extremos (Figura 5). Las barras son de 60 cm por encima del suelo.

2. Procedimiento

Para todas las pruebas, llevar los ratones a la sala experimental 5-20 min antes de la prueba, para asegurarse de que esté completamente despierto. Como regla general, para permitir la recuperación de la fuerza muscular y el retorno a los niveles normales de la excitación, el resto de los ratones por un retorno a la jaula después de cada prueba del motor. </ P>

2.1 rotarod

Ajuste el rodillo giratorio con una velocidad inicial de 4 rpm, velocidad de aceleración de 20 rpm / min. Al pasar el cursor por la cola, y colocarlo en la barra giratoria, de espaldas a la dirección de rotación por lo que tiene que caminar hacia adelante para mantenerse en pie. Esto es más fácil de hacer si el ratón es llevado hacia la varilla en un ángulo de 45 ° debajo de la horizontal; intentar bajar el ratón desde arriba resultará en que la difusión de sus patas traseras y agarrar los bordes de las bridas. Liberar rápidamente el ratón cuando se está casi tocando la barra, justo delante de y por encima de las barras de punto muerto superior, lo que le permite agarrar fácilmente la varilla. Una técnica (probablemente más fácil y más fiable) es utilizar un (10-15 mm) espiga delgada. Sosteniendo el ratón en una mano, bajarlo a la espiga, en paralelo al eje largo. El pasador está inclinada con la cabeza hacia abajo del ratón sobre 30 ° para darle más tiempo para agarrar el rotarod una vez que se libera. Baje el ratón y el pasador entre los díase bridas de la varilla rotatoria, y una vez más de la rotación de la varilla del tire de los pasadores hacia abajo lejos de la del ratón, que sujete la varilla y caminar hacia delante.

A los 10 segundos después de colocar el puntero del ratón sobre la barra, iniciar la aceleración (siempre y cuando el ratón está mirando hacia adelante: si no, espere hasta que se hace la cara hacia adelante antes de comenzar la aceleración), y tenga en cuenta la velocidad a la que el ratón se cae. Si se cae antes de 10 segundos, tenga en cuenta el momento de la caída y volver a intentarlo, hasta tres veces en total, registrando la velocidad a la primera caída después del punto 10 seg. Sin embargo, las caídas antes de 5 segundos, que se debe a una mala colocación por el experimentador no debe ser registrado. La velocidad media de caída es el dato, en lugar de utilizar la velocidad máxima, esto corrige para la práctica extra el ratón recibe durante las tiradas fallidas, que se supone ayudaría rendimiento. Por lo tanto un ratón que cae antes de 10 segundos una vez y luego se queda en hasta 12 rpm, las puntuaciones de segundo tiempo (4 12) / 2 = 8 rpm. Un ratón que cae dos veces y luegopermanecer durante 10 rpm puntajes (4 +4 +10) / 3 = 6 rpm. Si el ratón no se agarre en 10 segundos tres veces asignan una puntuación de 4 rpm.

Un problema es que los ratones a veces dejan de caminar hacia adelante y agarrar la barra con firmeza en su lugar, para que pasivamente voltereta ronda, aunque la mayoría finalmente se caen. Por lo tanto, podría ser útil tener en cuenta también la velocidad cuando se produce la primera inversión. Una posible solución podría ser utilizar una varilla con un diámetro más grande o más crestas menos pronunciadas.

2.2 Las barras horizontales

Dado que los ratones les resulta más fácil de comprender la estrecha barra de 2 mm, es recomendable probarlos primero en este caso. Al pasar el cursor por la cola, colocarlo en el banco delante del aparato, deslice rápidamente hacia atrás unos 20 cm (esto lo alinea perpendicular a la barra), rápidamente levantarla y dejar que agarre la barra horizontal en el punto central con sus patas delanteras solamente, y la liberación de la cola, que comienzan simultáneamente el cronómetro. Este cun ser difícil de lograr de manera eficiente, algunos ratones agarre mejor si la cola se libera repentinamente; si sienten que todavía están soportados pueden dejar de agarre. El punto de criterio es tanto una caída de la barra antes de que el ratón llega a una de las columnas de extremo de la barra, o el tiempo hasta la una pata toca una columna. Tiempo de la prueba máxima (hora de cierre) es de 30 seg.

Si el ratón no puede agarrar la barra debidamente primera vez y esto parece ser atribuible a la técnica del experimentador, en lugar del ratón, inténtelo de nuevo (después de un breve descanso, mientras que uno o dos ratones se ponen a prueba) y no registrar este otoño. Si el ratón se cae antes de 5 segundos, y esto no se debe aparentemente a una mala colocación por el experimentador, repetir hasta tres veces en un intento de llegar a> 5 puntaje sec. Si> 5 segundos en el segundo intento, no hacer un tercer ensayo. Tome la mejor puntuación como el punto de referencia. Un ratón que no varias veces para sostenerse durante> 5 seg puntajes sólo 1.

Si se utiliza la versión de triple barra, si las puntuaciones del ratón 5 en este primer bar 2 mm que puede entonces ser probado en las barras más gruesas, después de un breve período de descanso, mientras que uno o dos ratones se ponen a prueba. El sistema de puntuación de las barras 4 y 6 mm es el mismo que el de la barra de 2 mm, y el resultado final es el total acumulado. Así, un ratón que anota 5 en la barra de 2 mm, pero se cae de la barra de 4 mm después de 13 seg puntuaciones 5 +3 = 8.

2.2.1

Hacer las barras horizontales: los dos primeros intervalos son menos de los dos últimos como una vez que los ratones han dominado inicialmente la tarea que son menos propensos a caer:
La caída de entre 1-5 seg = 1
La caída de entre 6-10 segundos = 2
La caída de entre 11 a 20 segundos = 3
La caída de entre 21 a 30 segundos = 4
La caída a los 30 segundos = 5
Colocar una pata en un soporte de la barra sin caer = 5

NB como el uso opcional de barras 4 y 6 mm es una nueva adición a nuestro protocolo todavía no disponemos de una ampliaexperimentar con ellos.

2.3 barras estáticas

Coloque el ratón en el extremo de la varilla de ancho (longitud de la nariz punta de la cabeza del extremo es ideal). Tomar dos medidas: tiempo de la orientación (tiempo necesario para orientar 180 ° desde la posición de partida hacia la plataforma) y el tiempo de tránsito (el tiempo necesario para viajar a la punta de la estantería (nariz más allá de la marca de 10 cm de la punta de la estantería de la varilla).

Orientación depende del ratón permanecer en posición vertical, y si gira al revés y se aferra por debajo de la varilla, de manera arbitraria asignarlo (para fines estadísticos) la puntuación máxima orientación de 120 seg. No pruebe en barras más pequeñas, también el tiempo de tránsito se convierte en el valor máximo como un ratón que transita vertical es, obviamente, mejor coordinada que una que transita mientras colgaba de cabeza.

Si, después de la orientación, el ratón se cae o se alcanza el tiempo de la prueba máxima (arbitrariamente fijado en 120 segundos) no probarlo en sbarras de Menores. Para fines estadísticos, los ratones se asignan asignan caída de 120 para que la varilla particular y para los subsiguientes, ya que se supone que se volverá a caer a partir de una varilla estrecha. Si el ratón se vuelve al revés, también se nota de este evento, para el tránsito de éxito, así como la orientación que debe permanecer en posición vertical sobre la barra. De lo contrario asignar la máxima puntuación. Retire el ratón después de que alcance el extremo de la varilla o caídas.

Después de probar en una varilla de devolver el ratón a la jaula para descansar mientras se prueba otro ratón. A continuación, colóquelo en la siguiente barra de tamaño más pequeño y probarlo en la misma manera. Detener las pruebas si el ratón se cae una barra después de estar en él durante más de 5 segundos. Si se cayó en menos de 5 segundos reemplazarlo y permitir otro intento (como pertenecientes a 5 segundos podría ser debido a la colocación incorrecta por parte del experimentador), por un máximo de tres ensayos, y utilizar el mejor resultado.

2.4 Barras paralelas

Coloque el ratón en tque el centro de las dos barras con su eje longitudinal perpendicular a la de las barras; ambas patas delanteras deben estar en una barra, las dos patas traseras en la otra barra. La puntuación es similar a la de las barras estáticas. Tome dos medidas: el tiempo necesario hasta que el ratón orienta 90 ° a la posición de inicio y el tiempo hasta que posteriormente llega a uno de los soportes extremos. Si el ratón se vuelve al revés, también se nota de este evento. En cuanto a las barras estáticas deben alcanzarse prueba, la orientación y el tránsito sin que se convierta al revés, de lo contrario el tiempo máximo que se adjudican. Es raro que los ratones razonablemente saludables a caer en menos de 5 segundos, y si esto sucede es probable que sea debido a la mala colocación. Por lo tanto descartar el resultado y volver a probar el ratón.

Representative Results

Resultados Esperados

Una varilla estática se utilizó originalmente para monitorear el progreso de la enfermedad de Huntington en ratones mutantes, con o sin enriquecimiento ambiental en sus jaulas de origen ^14. El programa de enriquecimiento de retraso drásticamente la aparición de disfunción motora en la varilla, lo que fue acompañado de un retraso en el inicio de la pata trasera juntando, un signo general de deterioro neurológico.

Tembladera de los ratones infectados mostraron una disminución en el rendimiento de barra horizontal de 16 semanas después de la inyección, en la prueba de rotarod de 18 semanas, y las varillas estáticos a partir de al menos 19 semanas ⁸ (no se realizó las pruebas anteriores). KATP canal subunidad Kir6.2 ratones KO fueron perjudicados en las varillas estáticas y la barra horizontal, pero no en el cilindro giratorio ^4. Las lesiones del hipocampo no tuvieron efecto sobre cualquier medida de la capacidad del motor ^5, pero los ratones 129S2/Sv fueron perjudicados en relación con la cepa C57BL / 6 en las varillas de rotarod y estática ^3. C57BL/10 ratones también tenían el rendimiento del motor peor que C57BL / 6 ratones de ^6, aunque no en la misma medida que los ratones 129S2/Sv.

Figura 1. El cilindro giratorio.

Figura 2. Detalle de la varilla estriada del rodillo giratorio.

Figura 3. Las barras horizontales triples El bar se celebró en las muescas es la básica de 2 mm; uno. Tachuelas debajo de ella (sólo para fines de demostración) son las barras de 4 y 6 mm. En la práctica, sólo un bar a la vez se encaja en los soportes con muescas.

La Figura 4. Un ratón que atraviesa una varilla estática.

Figura 5. Un ratón sobre las barras paralelas. Relleno se ha omitido a efectos de demostración.