Måling Motor Koordinering i mus

Summary

Protokoller er præsenteret for to etablerede motoriske opgaver, den accelererende rotarod og horisontale bar, også to test udviklet i Oxford nylig, de statiske stænger og parallelle barer. Disse tests kan opdage motorkøretøjer nedskrivninger potentielt af interesse i deres egen ret, såvel som værende mulige variable i test af andre områder af adfærd.

Abstract

Mus bliver i stigende grad brugt i adfærdsmæssige neurovidenskab, stort set erstatte rotter som adfærdsforsker s dyr af valg. Før aspekter af adfærd såsom emotionalitet eller kognition kan bedømmes, men det er vigtigt at fastslå, om de motoriske evner af fx en mutant eller læderede mus tillader en sådan vurdering. Ydeevne på en labyrint opgave, som kræver styrke og koordination, såsom Morris water maze, kan meget vel blive svækket i en mus af motor, snarere end kognitive, svækkelse, så det er vigtigt at selektivt dissekere sidstnævnte fra det tidligere. For eksempel forårsagede sensorimotorisk svækkelser af NMDA-antagonister har vist sig at hæmme vand labyrint resultater ^2..

Motorik er traditionelt blevet vurderet i mus og rotter ved rotarodtesten, hvor dyret er placeret på en vandret stang, der roterer omkring sin længdeakse dyret skal gå fremad til at forblive oprejst og ikke falder af.Både indstillede hastighed og accelererende versioner af rotarod er tilgængelige.

De andre tre prøver beskrevet i denne artikel (vandret bar, statiske stænger og parallelle stænger) alt foranstaltning koordinering på statisk apparat. Den vandrette linje kræver også styrke til tilstrækkelige præstation, især forbenene som musen oprindeligt griber bar lige med forpoterne.

Voksne rotter ikke klarer sig godt på tests såsom de statiske stænger og parallelle stænger (personlige observationer), de synes mindre godt koordineret end mus. Jeg har kun testet hanrotter, dog, og hanmus synes generelt mindre godt koordineret end kvinder. Mus synes at have en højere styrke: vægtforhold end rotter, det latinske navn, Mus musculus synes ganske passende. Rotarod, er variationerne af foden fejl test ¹² eller Catwalk (Noldus) ¹⁵ apparat generelt bruges til at vurdere motorik hos rotter.

Introduction

Behavior bliver manifesteret ved handling, og handling kræver motoriske færdigheder, herunder koordinering af kroppen. Et af de første forsøg i historien om dyrs adfærd blev udført af Colin Stewart, en ph.d.-studerende ved Clark University i USA ^11.. Han målte aktiviteten af ​​rotter ved at sætte dem ind i en tromle og tælles det antal gange det viste. Denne tidlige apparat var sandsynligvis forløberen for kørende hjul og den for tiden anvendte rotarodtesten, omend i Stewart apparat rotten var inde i tromlen, hvis bevægelse blev drevet af rotte, mens rotarod dyret går på ydersiden af en roterende tromle eller stang, der er motordrevet.

Den oprindelige stang anvendes af Dunham og Miya (1957) ⁷ havde et sæt hastighed, men i dag accelererende versioner (Jones og Roberts 1968) ⁹ er tilgængelige. Ulempen ved en indstillet hastighed rotarod er, at nogle dyr med dårlig koordinering vil falde ud påstarten, mens der for dem, der bliver på, vil testen snart begynde at måle udholdenhed snarere end koordinering per se. Den resulterende bimodal fordeling af datapunkter kan være tilstrækkelig unormal, at de forhindrer parametrisk analyse. Når en accelererende rotarod anvendes, især hvis det accelereres kun når et sæt kriterium, såsom opholder sig på i 10 sek, er opnået, datadistribution er mere tilbøjelige til at være Gaussisk. Den acceleration kan indstilles således, at motoren træthed ikke spiller en væsentlig rolle i udførelsen, en mus er usandsynligt, at markant trætte efter blot 2-3 min tid på rotarod.

Den "string test" ¹ "bøjle test" eller vandret bar måler forelimb styrke og koordination. De to citerede skældsord henvise til sin udvikling, oprindeligt en streng blev brugt, men forfatterne bemærkede, at ydeevnen afhang meget af, hvordan stram snoren var dermed fremtidige eksperimentatorer brugt en metalstang, ofte en bøjle. Vi har fundet, at en mus evne til at gribe fat i stangen er omvendt proportional med dens diameter, og har standardmæssigt anvendt en 2 mm bar. I vægtene test (se JOVE protokol "Måling af styrken af ​​mus"), den meget fine tråd af en kedel pels / kalkopsamler tillader de stærkeste dyr for at sikre sådan et godt greb, at de kan løfte mere end deres egen kropsvægt. Imidlertid kan anvendelse af større diameter vandrette bjælker være en fordel, da følsomheden af ​​testen forbedres; med kun et 2 mm bar fleste normale C57BL / 6 mus nå loft ydeevne. Derfor har vi for nylig vedtaget en tre-bar apparat; stængerne let kan udskiftes, da de passer ind i hak skåret i toppen af ​​de bærende søjler. Søjlerne holdes under spænding (især vigtigt at gøre 2 mm bar stive), da de kun passer hakkene når understøtningerne er let trækkes sammen (ligesom en langbue og dens string) (se figur 3).

Statiske stænger eller bjælker er ofte blevet brugtat måle koordinering, men yderligere motivation var altid bruges til at overtale dyrene at krydse stangen. De forhandlede en vandret bjælke for at nå et ønsket mål, såsom for burene, tilflugt fra en lys, eller fødevarer (hvis de er blevet gjort sulten). Men i forbindelse med undersøgelsen af ​​denne type test, opdagede jeg, at mus spontant ville vende rundt når de placeres på den "åbne" ende af en fritbærende stang, og derefter krydse det, indtil de nåede den understøttede ende. Denne teknik eliminerer behovet for uddannelse (nødvendig i de tidligere omtalte test varianter) som den medfødte reaktion af en mus til at blive placeret nær enden af ​​en forhøjet stang er at forsøge at nå den understøttede ende. Dette betyder naturligvis ikke, fjerne det problem, at motiverende ændringer kan påvirke ydeevnen, hvilket altid er en mulighed med denne type procedure.

Pap tunneler er i øjeblikket meget brugt til hjemmet bur miljøberigelse, men deres dårligtudsigtspunkt i denne sammenhæng er, at dyr uvægerligt vil blive praktiseret i balancing på flasker, der kan slingre om deres lange akse, efterligne de nødvendige færdigheder til at balancere på rotarod. Således hjembur berigelse potentielt kunne maskere en adfærdsmæssig fænotype, et eksempel er bedring af en Huntingtons sygdom fænotype ved berigelse ^14.. Også dyrene ofte gå langs den lange akse af disse tunneler, som når walking langs en forhøjet statisk stråle. Derfor har jeg bygget et par af forhøjede parallelle stænger og placeret mus i midten med forpoterne på én bar og bagpoter på den anden en situation, som de aldrig ville have stødt på før. Mus havde at nå slutningen støtter af de parallelle stænger, mens de resterende oprejst for at bestå prøven. En noget lignende anordning var en serie af parallelle stænger placeret i en mus bur for at vurdere udviklingen af scrapie-induceret motorisk dysfunktion ^13..

Vi har nu testet flere hundredemus til motor fungerer ved Oxford. Disse havde modtaget forskellige behandlinger, herunder farmakologiske midler, eller passiv overførsel af væv (plasma) fra mennesker, men for det meste genetisk modificerede dyr. Nogle dyr var mere forringet på styrke end koordineringsopgaver, andre vice versa. Nogle mus var mere forringet på rotarod end på statiske substrater, såsom de statiske stænger og parallelle barer, andre vice versa. Så den nuværende artiklen og den ledsagende JOVE protokol "Måling styrke i mus") beskriver, hvordan du karakterisere den måde forskellige behandlinger og mutationer kan differentielt påvirke motorik hos mus. Bortset fra rotarod det her beskrevne apparatur er enkel, billig og særligt egnet til laboratorier ikke specialiseret til afprøvning motoriske færdigheder. For fine-skala ganganalyse er Catwalk-systemet en langt mere sofistikeret system end ældre metoder såsom at overtale en mus til at gå gennem en blæk bad og derefter ned et stykke papir, men det er en expensive stykke apparatur.

Alle disse test er designet til at måle koordinering snarere end styrke, selv om det naturligvis en minimal grad af muskeltonus er nødvendig blot for musen til at bruge sine lemmer. For styrken vurdering er den omvendte skærm procedure ¹⁰ mere passende, eller, hvis en mere gradueret måling er påkrævet, vægte testen eller dens automatiske bar-pull ækvivalent (beskrevet i JOVE protokol "Måling styrke i mus"). Undtagelsen er den vandrette bjælke test, som kræver både styrke og koordination for en vellykket performance.

Protocol

1.. Apparatur

For alle prøver, er en blød polstret overflade placeret i bunden af ​​apparatet til at afbøde eventuelle mus, der falder af. NB: Dette er ikke vist i figurerne, for ikke at tilsløre nogen del af apparatet. Under afprøvning af hundredvis af mus, både normale og mutant har vi aldrig set nogen skade forårsaget af falder fra sådant apparatur, som typisk er 30-50 cm høje. Også være sikker på at rengøre og sterilisere udstyr mellem hver testet mus.

1,1 rotarod

Der er flere kommercielle versioner af dette apparat på markedet, men nogle har ulemper, såsom at undlade at accelerere med en passende hastighed for at detektere manglende motorisk koordination (snarere end udholdenhed). En anden almindelig fejl er, at stangen ikke er højt nok over basen, hvilket resulterer i mus tendens til at falde eller springe ud.

Rotarod vist i figur 1 blev gjort til designaf forfatteren blandt ingeniør dele af Farmakologisk Institut, University of Oxford. Stangen er 3 cm i diameter, støttet 30 cm over bunden af ​​apparatet. Overfladen er riflet i en serie af parallelle kamme langs den langsgående akse, så musene at gribe det effektivt (figur 2). NB Dybden af ​​kammene er en afgørende detalje, hvis musen ikke kan få et godt greb testen vil være meget hårdere, og på den anden side, hvis grebet er for godt musen vil "vejrmølle" omkring stangen ved passivt at holde på den. For "amatør rotarod makers" kan det være nyttigt at vide, at riflede træ Dyvling af en passende størrelse for mus er kommercielt tilgængeligt, vil det naturligvis skal behandles med en god vandtæt lak før brug. Starten hastigheden justeres til 4 rpm, accelerationsrampen til 20 rpm / min. Maksimal hastighed er 40 rpm.

To flanger forhindrer musen i at forlade stangen. De er 30 cm i diameter (dettekunne sandsynligvis blive reduceret til 20 cm). Deres adskillelse er fastsat til 6 cm (maksimum), men kan være nødvendigt at justere mindre for sub-voksne mus, hvis de har tendens til at vende rundt på stangen.

1.2 Triple vandrette stænger (figur 3)

Søjlerne er fremstillet af messing, 38 cm lang, holdt 49 cm over bordoverfladen ved en trælister kolonne i hver ende. Kolonnerne er fastgjort til en tung træ base. Tre bar diametre er tilgængelige: 2, 4 og 6 mm. De 2 mm bar er den standard, vi bruger, men mange mus nå maksimum score på dette. Derfor større diameter barer er medtaget i et forsøg på at forfine testen, da mus ikke kan gribe disse, så godt.

1.3 Statiske stænger

Fem trædyvler eller stænger af varierende tykkelse (35 (stang 1), 28, 22, 15 og 9 (stangen 5) mm diameter) hver 60 cm lang fastsættes af en G-clamp til et laboratorium hylde således at stængerne vandret rage i rummet (figur 4). Endenaf stangen nær bænken har en mark 10 cm fra enden, til at betegne målstregen. Højden af ​​stængerne over gulvet er 60 cm.

Hvis en kortere og mindre detaljeret test er påkrævet, bruger kun de største, mindste og midterste stænger. Van Dellen et al. ^14, kun en enkelt stang til at vurdere forløbet af Huntingtons sygdom i mus.

1.4 Parallelle stænger

To parallelle stålstænger 1 m lang og 4 mm i diameter er fastgjort 30 mm (på deres centre) fra hinanden ved træ bæresøjler ved deres ender (figur 5). Søjlerne er 60 cm over gulvet.

2.. Procedure

For alle prøver, bringe mus til den eksperimentelle rum 5-20 min før testen for at sikre, at de er helt vågen. Som en generel regel, for at tillade genvinding af muskelstyrke og en tilbagevenden til normale niveauer af ophidselse, hvile mus ved en tilbagevenden til hjemmet bur efter hver motor test. </ P>

2,1 rotarod

Sæt rotarod med en start hastighed på 4 rpm, acceleration 20 rpm / min. Holde musen i halen, og placer det på den roterende stang, vender væk fra rotationsretningen så det har at gå frem til at bo oprejst. Dette er lettest at gøre, hvis musen er bragt op mod stangen i en vinkel på 45 ° under vandret forsøger at sænke musen ovenfra vil resultere i det sprede sine bagben og gribe kanterne af flangerne. Hurtigt slippe musen, når den næsten rører stang, lige fremad og over stængerne topstilling, gør det muligt at nemt at gribe fat i stangen. A (sandsynligvis lettere og mere pålidelige) teknik er at bruge en tynd (10-15 mm) dyvel. Holde musen i den ene hånd, sænke den til dyvel, parallelt med den lange akse. Dyvel er vinklet med musens hovedet nedad omkring 30 ° for at give det mere tid til at gribe rotarod når den frigives. Sænk musen og dyvel mellem the flanger rotarod, og en gang over den roterende stang pull dyvel nedad væk fra musen, som vil gribe stangen og gå fremad.

Ved 10 sek efter at placere musen på stangen, start acceleration (så længe musen vender fremad: hvis ikke, vente, indtil det gør ansigt frem, før du starter acceleration), og bemærk den hastighed, hvormed musen falder. Hvis den falder ud, før 10 sekunder, skal du notere tidspunktet for efteråret og prøv igen, op til tre gange i alt, registrerer hastigheden ved første fald efter 10 sek point. Dog falder inden 5 sek, som skyldes dårlig placering af forsøgslederen skal ikke registreres. Den gennemsnitlige hastighed ved faldet er det datum, snarere end at bruge den maksimale hastighed, det korrigerer for den ekstra praksis musen modtager i løbet af de mislykkede kørsler, som den antages ville hjælpe performance. Således vil en mus, der falder inden 10 sek gang, så bliver på indtil 12 rpm anden gang scores (4 +12) / 2 = 8 rpm. En mus falder to gange såopholder sig på til 10 rpm scoringer (4 +4 +10) / 3 = 6 rpm. Hvis en mus ikke greb i 10 sek tre gange tildele det en score på 4 rpm.

Et problem er, at mus undertiden stoppe walking fremad og gribe stangen fast i stedet, så de passivt salto runde, selv om de fleste efterhånden falde. Det kunne derfor være nyttigt også at notere hastigheden, når den første inversion opstår. En mulig løsning kunne være at bruge en stang med en større diameter eller mindre udtalt kamme.

2.2 Vandrette barrer

Som mus finder det lettest at forstå den smalle 2 mm bar, er det tilrådeligt at teste dem først på denne ene. Holde musen i halen, skal det placeres på bænken foran apparatet, lad den hurtigt glide baglæns omkring 20 cm (dette bringer det vinkelret på bar), hurtigt hæve den, og lad den gribe den vandrette bjælke det centrale punkt med sine forpoter kun vejledende, og slip hale, samtidig starter stopclock. Denne cet være vanskeligt at opnå effektivt; nogle mus greb bedre, hvis halen er frigivet pludseligt, hvis de føler, de er stadig understøttet de kan undlade at greb. Kriteriet punkt er enten et fald fra baren før musen når en af ​​slutningen kolonner af baren, eller tid indtil en forepaw rører en kolonne. Maksimal testtid (cut-off tid) er 30 sek.

Hvis musen ikke fatter baren ordentligt første gang og dette synes at kunne tilskrives de eksperimentatorens teknik, snarere end mus, prøv igen (efter en kort hvile, mens en anden én eller to mus testet), og registrerer ikke dette efterår. Hvis musen falder inden 5 sek, og dette er tilsyneladende ikke skyldes dårlig placering af eksperimentatoren, gentag op til tre gange i et forsøg på at få en> 5 sek score. Hvis> 5 sek på det andet forsøg, ikke gør en tredje retssag. Tag den bedste score som henføringspunkt. En mus, der gentagne gange undlader at forsørge sig selv for> 5 sek scoringer kun 1.

Hvis triple-bar versionen bliver brugt, hvis musen scores 5 på denne første 2 mm bar det kan så blive testet på tykkere stænger, efter en kort hvileperiode, mens en anden én eller to mus testes. Pointsystemet for 4 og 6 mm stænger er den samme som for 2 mm bar og det endelige resultat er den samlede kumulerede. Således vil en mus, der scorer 5 på 2 mm bar men falder fra 4 mm bar efter 13 sek scorer 5 +3 = 8..

2.2.1

Scoring de vandrette bjælker: de første to intervaller er mindre end de sidste to som når musene indledningsvis har mestret den opgave, de er mindre tilbøjelige til at falde:
Falling mellem 1-5 sek = 1
Falling mellem 6-10 sek = 2
Falling mellem 11-20 sek = 3
Falling mellem 21-30 sek = 4
Falling efter 30 sek = 5
Placere en forpote på en bar support uden at falde = 5

NB som valgfri brug af 4 og 6 mm stænger er en ny tilføjelse til vores protokol vi endnu ikke har omfattendeerfaring med dem.

2.3 Statiske stænger

Placer musen i den fjerneste ende af den bredeste stangen (næsetippen ét hoved længde fra enden er ideel). Tag to foranstaltninger: orientering tid (tid at orientere 180 ° fra startpositionen mod hylde) og transit tid (den tid det tager at rejse til hylden ende (næse ud over 10 cm-mærket fra hylden ende af stangen).

Orientering er afhængig af musen opholder oprejst, hvis det viser hovedet og klynger under stangen, vilkårligt tildele den (til statistiske formål) den maksimale orientering score på 120 sek. Må ikke teste det på mindre stænger, også transittiden bliver den maksimale værdi som en mus, der passerer oprejst er naturligvis koordineres bedre end en, der passerer mens hængende på hovedet.

Hvis efter orientering falder med musen eller den når den maksimale testtid (vilkårligt sat til 120 sek) ikke teste det på sMøller stænger. Til statistiske formål er tildele mus falder tildelt 120 for den pågældende stang og for efterfølgende dem, da det antages at de igen ville falde fra en smallere stang. Hvis musen vender på hovedet, også bemærke denne begivenhed; for en vellykket transit samt orientering skal det forblive oprejst på stangen. Ellers tildele den maksimale score. Fjern musen efter den når enden af ​​stangen eller fald.

Efter undersøgelsen på en stang returnere mus til hjemmet buret for at hvile, mens du teste en anden mus. Derefter placere den på den næste mindre størrelse stang og teste det på samme måde igen. Stop test, hvis musen falder ned fra en stang efter at være på det for mere end 5 sek. Hvis den faldt i mindre end 5 sek erstatte det og tillade endnu et forsøg (som henhører under 5 sek kunne skyldes defekt placering af forsøgslederen), for højst tre forsøg, og brug det bedste resultat.

2.4 Parallelle stænger

Placer musen i than midten af ​​de to søjler med sin længdeakse vinkelret på de barer, begge forpoter bør være på én bar, begge bagpoter på den anden bar. Scoring er den samme som for de statiske stænger. Tag to foranstaltninger: den tid, der går, musen orienterer 90 ° til startpositionen, og tiden indtil den senere på en af ​​enden understøtter. Hvis musen vender på hovedet, også bemærke denne begivenhed. Med hensyn til de statiske stænger test, orientering og transit skal opnås uden at det udviklede sig på hovedet, ellers den maksimale tid er tildelt. Det er sjældent, rimeligt raske mus til at falde i mindre end 5 sekunder, hvis dette sker, er det sandsynligvis på grund af dårlig placering. Derfor kasseres resultatet og teste musen.

Representative Results

Forventede resultater

En statisk stang blev oprindeligt brugt til at overvåge fremskridtene i Huntingtons sygdom i mutant mus, med eller uden miljøberigelse i deres hjem bure ^14. Berigelse program dramatisk forsinket indtræden af ​​motorisk dysfunktion på stangen, som blev modsvaret af en forsinkelse i starten af ​​bagpote slår, en generel tegn på neurologisk svækkelse.

Scrapie-inficerede mus viste et fald i vandret stang ydeevne fra uge 16 efter injektion i rotarod test fra uge 18, og statiske stænger fra mindst uge 19 ⁸ (tidligere test blev ikke udført). KATP kanal subunit Kir6.2 KO mus blev forringet på de statiske stænger og vandrette bjælke, men ikke på den roterende stav ^4.. Hippocampus læsioner havde ingen effekt på enhver foranstaltning af motorisk evne ^5, men 129S2/Sv mus blev forringet i forhold til C57BL / 6 belastning rotarod og statiske stænger ^3. C57BL/10 mus havde også dårligere motorisk præstation end C57BL / 6 mus ^6, men ikke i samme omfang som 129S2/Sv mus.

Figur 1. Rotarod.

Figur 2. Detalje af den riflede stang rotarod.

Figur 3. Den tredobbelte vandrette bjælker Baren afholdt i hakkene er den grundlæggende 2 mm én,. Dingler under den (til demonstration kun) er de 4 og 6 mm stænger. I praksis er kun én bar på et tidspunkt indpasses i det takkede støtter.

Figur 4.. En mus gennemkører en statisk stang.

Figur 5. En mus på parallelle stænger. Polstring er udeladt kun til demonstration.