Måle motorisk koordinasjon i Mus

Summary

Protokoller presenteres for to etablerte motoriske oppgaver, den akselererende rotarod og horisontal bar, også to tester utviklet i Oxford nylig, de statiske stenger og parallelle barer. Disse testene kan detektere motoriske svekkelser potensielt av interesse i seg selv, samt å være mulige varianter i tester av andre områder av virkemåten.

Abstract

Mus brukes i økende grad i atferdsmessige nevrovitenskap, i stor grad erstatte rotter som observatør er dyr av valget. Før aspekter av atferd som emosjonalitet eller kognisjon kan vurderes, men det er viktig å finne ut om de motoriske evnene til f.eks en mutant eller lesioned mus tillate en slik vurdering. Ytelsen i en labyrint oppgave som krever styrke og koordinasjon, slik som Morris vann labyrint, kan godt være svekket i en mus ved motor, snarere enn kognitive, svekkelser, så det er viktig å selektivt dissekere sistnevnte fra førstnevnte. For eksempel forårsaket sensorisk-svekkelser ved NMDA-antagonister er blitt vist å nedsette vann labyrint ytelse ^2..

Motorisk koordinasjon har tradisjonelt vært undersøkt i mus og rotter ved rotarod test, der dyret plasseres på en horisontal stang som roterer om sin egen lengdeakse; dyret må gå forover for å holde seg oppreist og ikke faller av.Begge satt fart og akselererende versjoner av rotarod er tilgjengelig.

De tre andre testene som er beskrevet i denne artikkelen (horisontal bar, statiske stenger og parallelle barer) alle mål koordinering på statisk apparat. Den horisontale linjen krever også styrke for tilstrekkelig ytelse, spesielt av forbein som mus i utgangspunktet grep baren bare med forbeina.

Voksne rotter ikke utfører godt på tester som de statiske stenger og parallelle barer (personlige observasjoner), de synes mindre godt koordinert enn mus. Jeg har bare testet hannrotter, imidlertid, og hannmus synes generelt mindre godt koordinert enn hunnene. Mus synes å ha en høyere styrke: vekt-forhold enn rotter, det latinske navnet, Mus musculus, virker helt riktig. Den rotarod, er varianter av foten feil test ¹² eller catwalk (Noldus) ¹⁵ apparater vanligvis brukt for å vurdere motorisk koordinasjon hos rotter.

Introduction

Atferd tilkjennegis av handling, og handling krever motoriske ferdigheter, inkludert koordinering av kroppen. En av de første eksperimentene i historien om dyrs atferd ble utført av Colin Stewart, en doktorgradsstudent ved Clark University i USA ^11.. Han målte aktivitet hos rotter ved å sette dem inn i en trommel og telles antall ganger det viste. Denne tidlige apparat var sannsynligvis forløperen til løpehjulene og den for tiden brukte rotarod test, enskjønt i Stewart apparat rotten var inne i trommelen, bevegelsen av som ble drevet av den rotte, mens i rotarod dyret går på utsiden av en roterende trommel eller stang, som er motordrevet.

Den opprinnelige stang brukes av Dunham og Miya (1957) ⁷ hadde en fast hastighet, men i dag akselererende versjoner (Jones og Roberts 1968) ⁹ er tilgjengelig. Ulempen med en satt hastighet rotarod er at noen dyr med dårlig koordinering vil falle av påstarten, mens det for de som ikke liggende på, vil testen begynner snart å måle utholdenhet i stedet for koordinering per se. Den resulterende bimodal fordeling av datapunkter kan være tilstrekkelig unormalt at det forhindrer parametrisk analyse. Når en akselererende rotarod brukes, særlig hvis den er akselerert bare når et sett kriterier, slik som bor på i 10 sekunder, er oppnådd, er datafordelingen større sannsynlighet for å være gaussisk. Frekvensen av akselerasjon kan justeres slik at motoren trøtthet ikke spiller en betydelig rolle i ytelse, en mus er trolig ikke markert utmattet etter bare 2-3 min tid på rotarod.

Den "streng test" ^en, "kleshenger test" eller horisontal bar måler forbena styrke og koordinasjon. De to skjellsord siterte referere til sin utvikling, opprinnelig en streng ble brukt, men forfatterne bemerket at ytelsen avhengig veldig mye på hvor stram strengen var, derav fremtidige forskere brukte en metallstang, ofte en kleshenger. Vi har funnet at en mus evne til å gripe stangen er omvendt proporsjonal med dens diameter, og har standardly brukt en 2 mm bar. I vekter test (se Jove protokoll "måle styrken på mus") veldig fine ledning av en kjele pels / skala solfangeren gjør de sterkeste dyrene for å sikre en så god grep som de kan løfte mer enn sin egen kroppsvekt. Imidlertid kan bruke større diameter horisontale bjelker være en fordel, da følsomheten av testen forbedrer, med bare en 2 mm bar de fleste normale C57BL / 6 mus nå tak ytelse. Derfor har vi nylig innført en tre-bar apparatur; stengene lett kan byttes om så de passer inn i hakk skjære inn i toppene av de søyler. Stolpene blir holdt under strekk (særlig viktig for å gjøre den stiv 2 mm bar) som de bare passer hakkene når støttene er svakt trukket sammen (som en langbuen og dens snor) (se figur 3).

Statiske stenger eller bjelker har ofte blitt bruktå måle koordinering, men ekstra motivasjon ble alltid brukt å overtale dyrene å krysse stangen. De forhandlet en horisontal bjelke for å nå et ønsket mål, slik som hjem buret, tilflukt fra et sterkt lys, eller mat (hvis de er blitt gjort sulten). Men i løpet av undersøke denne type test, oppdaget jeg at mus ville spontant snu når den plasseres på "åpen" enden av en utkraget stang, og deretter krysse den før de nådde støttet slutten. Denne teknikk eliminerer behovet for opplæring (nødvendig i den tidligere nevnte test-varianter) som medfødt reaksjon av en mus til å være plassert nær enden av en forhøyet stang er å forsøke å nå den støttede enden. Dette betyr ikke, selvfølgelig, eliminere problemet som motiverende endringer kan påvirke ytelsen, er som alltid en mulighet med denne type prosedyre.

Papp tunneler er i dag mye brukt til hjemme buret miljøberikelse, men deres vanskeligstilteutsiktspunkt i denne sammenheng er at dyrene vil uunngåelig bli praktisert i balansering på sylindere som kan vingler om sin lange akse, etterligne den kompetansen som trengs for å balansere på rotarod. Dermed hjem bur berikelse potensielt kan maskere et atferdsmessig fenotype, et eksempel er forbedring av en Huntingtons sykdom fenotype av berikelse ^14. Også dyr ofte gå langs den lange aksen av disse tunnelene, som når vandre langs en forhøyet statisk stråle. Derfor har jeg laget et par av forhøyede parallelle barer, og plassert musene i midten med forpotene på en bar og hindpaws på den andre, en situasjon som de aldri ville ha møtt før. Mus måtte komme endestøttene av de parallelle stolper mens resterende oppreist for å bestå testen. En noe lignende anordning var en serie av parallelle stolper som er plassert i et bur mus for å vurdere utviklingen av skrapesyke-indusert motorisk dysfunksjon ^13..

Vi har nå testet flere hundremus for motor fungerer ved Oxford. Disse hadde fått ulike behandlinger, inkludert farmakologiske midler, eller passiv overføring av vev (plasma) fra mennesker, men for det meste genmodifiserte dyr. Noen dyr var mer svekket på styrke enn koordinering oppgaver, andre vice versa. Noen mus var mer svekket på rotarod enn på statiske underlag som de statiske stenger og parallelle barer, andre vice versa. Så denne artikkel og medfølgende Jove protokollen "Måle styrke i mus") beskriver hvordan å karakterisere måten ulike behandlinger og mutasjoner kan differentially påvirke motorisk funksjon hos mus. Bortsett fra rotarod apparatet beskrevet her er enkel, billig og spesielt egnet for laboratorier ikke spesialiserte for å teste motoriske ferdigheter. For fin-skala gangart analyse, er Catwalk systemet en mye mer sofistikert system enn eldre metoder som overtale en mus til å gå gjennom en blekk bad og deretter ned et stykke papir, men det er en expensive stykke apparatur.

Alle disse testene er utformet for å måle koordinasjon enn styrke, selv om det selvsagt en minimal grad av muskeltonus er nødvendig bare for musen til å bruke sine lemmer. For styrke vurdering, er det inverterte skjerm prosedyre ¹⁰ mer egnet, eller, hvis en mer gradert måling er nødvendig, vil vekt testen eller dens automatiske bar-pull ekvivalent (beskrevet i Jove protokoll "Measuring styrke hos mus"). Unntaket er den horisontale stangen test, som krever både styrke og koordinasjon for vellykkede resultater.

Protocol

En. Apparatus

For alle testene, er en myk polstret underlag plasseres på bunnen av apparatet for å dempe noen mus som faller av. NB Dette er ikke vist i figurene, for ikke å utydeliggjøre noen del av anordningen. Under testing av hundrevis av mus, både normal og mutant, har vi aldri observert noen skader forårsaket av fallende fra et slikt apparat, noe som er typisk 30-50 cm høy. Sørg også for å rense og sterilisere utstyret mellom hver mus testet.

1.1 Rotarod

Det finnes flere kommersielle versjoner av denne anordning på markedet, men noen har ulemper, for eksempel ikke å akselerere ved en tilstrekkelig hastighet til å detektere motorisk inkoordinasjon (i stedet for utholdenhet). En annen vanlig feil er at stangen ikke er høy nok over bunnen, noe som resulterer i mus tending å slippe eller hoppe av.

Den rotarod vist i figur 1 ble gjort til designav forfatteren av de tekniske delene av Institutt for farmakologi, Universitetet i Oxford. Stangen er 3 cm i diameter, understøttet 30 cm over bunnen i apparatet. Overflaten er riflet i en serie av parallelle rygger langs lengdeaksen, slik at musene for å gripe den effektivt (figur 2). NB Dybden av rygger er en viktig detalj, hvis musen ikke kan få et godt grep testen vil være veldig mye vanskeligere, på den annen side, hvis grepet er for godt til musen vil "cartwheel" rundt stangen ved passivt å holde på den. For "amatør rotarod makers" kan det være nyttig å vite at riflete tre fordypningsstenger av en passende størrelse for mus er tilgjengelig kommersielt, det ville selvsagt må behandles med en god vanntett lakk før bruk. Starten hastigheten er regulert til 4 omdreininger, akselerasjonen hastighet i 20 rpm / min. Maksimal hastighet er 40 rpm.

To flenser hindre mus fra å forlate stangen. De er 30 cm i diameter (dennekan trolig reduseres til 20 cm). Deres separasjon er satt til 6 cm (maksimum), men kan være nødvendig å justere mindre for sub-voksne mus hvis de har en tendens til å snu seg rundt på stangen.

1.2 Triple vannrette streker (figur 3)

Barene er laget av messing, 38 cm lang, holdt 49 cm over benken overflaten av en tre support kolonne i hver ende. Kolonnene er festet til en tung trebunn. Tre bar diametre er tilgjengelige: 2, 4 og 6 mm. Den 2 mm bar er standard vi bruker, men mange mus nå maksimal score på dette. Derfor større diameter barer har blitt inkludert i et forsøk på å avgrense testen, som mus ikke kan gripe disse så godt.

1.3 Statiske stenger

Fem treplugger eller staver av varierende tykkelse (35 (en stang), 28, 22, 15 og 9 (stang 5) mm diameter) med hver 60 cm lang festet i en G-klemmen til et laboratorium hylle slik at stengene rager horisontalt inn i mellomrommet (figur 4). Sluttenav stangen nær benken har et merke 10 cm fra enden, for å betegne mållinjen. Høyden av stavene over gulvet er 60 cm.

Hvis en kortere og mindre detaljert test er nødvendig, bruker bare de største, minste og midtre stenger. Van Dellen et al. ^14. brukes bare en eneste stang for å vurdere utviklingen av Huntingtons sykdom hos mus.

1.4 Parallelle barer

To parallelle stålstenger 1 m lang og 4 mm i diameter, er fast 30 mm (på deres midtpunkter) fra hverandre ved tre bærende søyler ved endene (figur 5). Linjene er 60 cm over gulvet.

2. Prosedyre

For alle tester, bringe mus til den eksperimentelle rom 5-20 min før testing, for å sikre at de er helt våken. Som en generell regel, for å tillate utvinning av muskelstyrke og vender tilbake til normale nivåer av opphisselse, hvile musene ved en retur til hjemmet buret etter hver motor test. </ P>

2.1 Rotarod

Sett rotarod med en start hastighet på 4 rpm, akselerasjon rente 20 rpm / min. Holder musen i halen, og plassere den på den roterende stang, vendt vekk fra rotasjonsretningen så det må gå frem for å stå oppreist. Det er enklest å gjøre om musen bringes opp mot stangen i en vinkel på 45 ° under horisontalplanet, forsøker å senke mus fra ovenfor vil resultere i den sprer bakbena og gripe kantene av flensene. Slipp raskt på musen når den er nesten berører stangen, bare frem av og over stengene øvre dødpunkt, slik at det enkelt kan gripe stangen. A (sannsynligvis enklere og mer pålitelig) teknikk er å bruke en tynn (10-15 mm) dybel. Holder musen i den ene hånden, senk den til pluggen, parallelt med den lange aksen. Pluggen er vinklet med musens hodet nedover ca 30 ° for å gi det mer tid til å gripe rotarod når den slippes. Senk mus og plugg mellom the flenser av rotarod, og en gang over det roterende stang den trekke dowel nedover bort fra musen, som vil ta tak i stangen og gå fremover.

På 10 sek etter å plassere musen på stang, starter akselerasjonen (så lenge musen er vendt fremover: hvis ikke, vent til den gjør ansiktet fremover før du starter akselerasjon), og legg merke til hvor raskt musen faller av. Hvis den faller av før 10 sek, merk tidspunktet for høsten og prøve igjen, opp til tre ganger totalt, innspilling hastigheten på det første fallet etter 10 sek punkt. Imidlertid faller før 5 sek som er på grunn av dårlig plassering av eksperimentator bør ikke tas opp. Det gjennomsnittlige hastigheten på fallet er nullpunktet, snarere enn å bruke den maksimale hastigheten, korrigerer dette for ekstra praksis musen mottar under de mislykkede løper, som antas ville hjelpe ytelse. Dermed en mus som faller før 10 sek gang da forblir på til 12 rpm andre gang score (4 +12) / 2 = 8 rpm. En mus faller dobbelt såbor på i 10 rpm score (4 +4 +10) / 3 = 6 rpm. Hvis en mus klarer å grep i 10 sek tre ganger tilordne den en score på 4 rpm.

Ett problem er at mus noen ganger slutter å gå frem og gripe stangen fast i stedet, slik at de passivt saltomortale runde, selv om de fleste til slutt faller av. Det kan derfor være nyttig å merke seg også hastigheten når den første slike inversjon inntreffer. En mulig løsning kan være å bruke en stang med større diameter eller mindre utpregede rygger.

2.2 Horisontale barer

Som mus synes det er lettest å forstå den smale 2 mm bar, er det lurt å teste dem først på denne. Holder musen i halen, legg den på benken foran apparatet, dra den raskt bakover ca 20 cm (dette justerer det vinkelrett på bar), raskt heve den og la den gripe den horisontale linjen på sentralt punkt med sine forpotene bare, og slipper halen, samtidig starter stopclock. Denne cen være vanskelig å oppnå effektivt, og noen mus grep bedre hvis halen slippes plutselig, hvis de føler at de fortsatt støttet de kan mislykkes i å feste. Kriteriet Poenget er enten et fall fra baren før musen når en av slutten kolonnene i baren, eller tid til en forpotene berører en kolonne. Maksimal test tid (cut-off tid) er 30 sek.

Hvis musen ikke klarer å ta tak i baren riktig første gang, og dette ser ut til å være knyttet til experimenter teknikk, snarere enn mus, prøv igjen (etter en kort hvile mens en annen en eller to mus er testet), og ikke ta opp denne høsten. Hvis musen faller før 5 sek, og dette er tydeligvis ikke på grunn av dårlig plassering ved experimenter, gjentar opp til tre ganger i et forsøk på å få en> 5 sek score. Hvis> 5 sek på andre forsøk, ikke gjør en tredje rettssak. Ta den beste poengsummen som nullpunkt. En mus som gjentatte ganger unnlater å støtte seg selv i> 5 sek score bare ett.

Dersom den trippel-bar versjon brukes, hvis musen resultatet 5 på denne første 2 mm bar det kan deretter testes på tykkere stolper, etter en kort hvileperiode, mens en annen eller to testes mus. Poenggivingen for de 4 og 6 mm stolpene er den samme som for den 2 mm bar, og sluttresultatet er den kumulerte totalt. Dermed en mus som scorer fem på 2 mm bar, men faller fra 4 mm baren etter 13 sekunder scorer 5 +3 = 8.

2.2.1

Scoring de horisontale strekene: de to første intervallene er mindre enn de to siste som når musene har i utgangspunktet mestrer oppgaven de er mindre tilbøyelige til å falle:
Faller mellom 1-5 sek = 1
Faller mellom 6-10 sek = 2
Faller mellom 11-20 sek = 3
Faller mellom 21-30 sek = 4
Faller etter 30 sek = 5
Plassere en forpotene på en bar støtte uten å falle = 5

NB som valgfri bruk av 4 og 6 mm barer er et nytt tillegg til protokollen vår vi ennå ikke har omfattendeoppleve med dem.

2.3 Statiske stenger

Plasser musen på enden av de bredeste stang (nesetippen en hodets lengde nederst er ideelt). Ta to tiltak: orientering tid (tiden det tar å orientere 180 ° fra startposisjon mot sokkelen) og transitt tid (den tiden det tar å reise til sokkelen slutten (nese utover 10 cm mark fra sokkelen enden av stangen).

Orientering er avhengig av mus bor oppreist, hvis det snur opp ned og klamrer seg under stangen, vilkårlig tilordne den (for statistiske formål) maksimal orientering score på 120 sek. Ikke teste den på mindre stenger, også transporten gangen, blir den maksimale verdien som en mus som transporter oppreist er åpenbart bedre koordinert enn en som transporter mens du henger på opp-ned.

Hvis du, etter å orientere, faller musen eller til den når maksimal test tid (vilkårlig satt til 120 sek) ikke teste det på sMaller stenger. For statistiske formål, er tildele mus fallende tildelt 120 for den aktuelle stang og for etterfølgende hendelsene, som det antas at de igjen skulle falle fra en smalere stang. Hvis musen snur opp ned, også oppmerksom på denne hendelsen, for vellykket transitt samt orientering må det stå oppreist på stangen. Ellers tilordne den maksimal score. Fjern musen etter den når enden av stangen eller faller.

Etter å ha testet på en stang returnere musen til hjemmet buret for å hvile mens du teste en annen mus. Deretter plasserer den på den neste mindre størrelse stang og teste den på samme måte igjen. Stopp testing hvis musen faller ned fra en stang etter å være på den i mer enn 5 sek. Hvis det falt av på mindre enn 5 sekunder erstatte den og la et annet forsøk (som faller innenfor 5 sek kan være på grunn av feil plassering av eksperimentator), for maksimalt tre forsøk, og bruke det beste resultatet.

2.4 Parallelle barer

Plasser musen i than midt mellom de to stolpene med sin lengdeakse vinkelrett på den av stolpene, begge forlabbene bør være på en bar, begge hind labbene på den andre linjen. Scoring er lik den for de statiske stenger. Ta to tiltak: tiden det tar før musen orienterer 90 ° til startposisjonen, og tiden til det senere når en av slutten støtter. Hvis musen snur opp ned, også oppmerksom på denne hendelsen. Som for de statiske stenger test, orientering og transitt må gjennomføres uten at det snu opp ned, ellers maksimal tid er tildelt. Det er sjelden rimelig sunne mus til å falle på mindre enn 5 sekunder, hvis dette skjer er det sannsynligvis på grunn av dårlig plassering. Derfor forkaste resultatet og test musen.

Representative Results

Forventede resultater

En statisk stang ble opprinnelig brukt til å overvåke fremdriften for Huntingtons sykdom i muterte musene, med eller uten miljøberikelse i sine hjem bur ^14. Berikelse program dramatisk forsinket utbruddet av motorisk dysfunksjon på stanga, som ble stadig av en forsinkelse i utbruddet av bakpote clasping, et generelt tegn på nevrologisk svekkelse.

Skrapesyke-infiserte mus viste en nedgang i horisontal bar ytelse fra uke 16 etter injeksjonen, i rotarod testing fra uke 18, og statiske stenger fra minst uke 19 ⁸ (tidligere testing ble ikke utført). KATP kanal subenheten Kir6.2 KO mus ble svekket på de statiske stenger og horisontal bar, men ikke på rotarod ^fire. Hippokampale lesjonene hadde ingen virkning på en hvilken som helst mål på motorens evne til ^5, men 129S2/Sv mus ble svekket i forhold til C57BL / 6 belastning på rotarod og statisk stenger ^3. C57BL/10 mus hadde også dårligere motor ytelse enn C57BL / 6 mus ^6, men ikke i samme grad som 129S2/Sv mus.

Figur 1. Den rotarod.

Figur 2. Detalj av den riflede stang av rotarod.

Figur 3. Den triple vannrette streker Baren holdt i hakkene er den grunnleggende 2 mm én;. Stiftet under den (kun for demonstrasjon) er de 4 og 6 mm barer. I praksis blir bare en søyle av gangen slisset inn i de innsnittede støtter.

Figur 4. En mus krysse en statisk stang.

Figur 5. En mus på de parallelle barer. Padding er utelatt for bare demonstrasjon.