Измерение моторной координации у мышей

Summary

Протоколы представлены в течение двух установленных моторной координации задач, ускорения Rotarod и турник, также две тестов, разработанных в последнее время в Оксфорде, статические стержней и брусьях. Эти тесты могут обнаружить моторные нарушения потенциальный интерес сами по себе, а как возможные переменные в тестах других областях поведения.

Abstract

Мыши все чаще используются в поведенческой неврологии, во многом заменив крыс, как животное бихевиористское выбора. Перед аспекты поведения, такие как эмоциональность или познавательной способности может быть оценено, однако, очень важно определить, является ли двигатель возможности, например, мутант или поврежденных мышь позволить такой оценки. Выступление на лабиринт задача, требующая силы и координации, такими как водном лабиринте Морриса, вполне может быть нарушена в мышиной мотором, а не познавательный, нарушений, поэтому важно, выборочно анализировать последнего от первого. Например, сенсомоторных нарушений вызванных NMDA антагонистов было показано, что ухудшает производительность водном лабиринте ^2.

Двигатель координации традиционно оценивали у мышей и крыс с помощью теста Rotarod, в котором животное помещают на горизонтальную стержень, который вращается вокруг своей продольной оси; животное должно идти вперед, чтобы оставаться в вертикальном положении и не упасть.Оба набора скорости и ускорения версии Rotarod имеются.

Остальные три испытания, описанные в этой статье (турник, статические стержней и брусьях) все меры координации на статической аппарата. Турнике также требует силы для адекватной производительности, особенно передних конечностей, как мышь первоначально захватывает бар только передними лапами.

Взрослые крысы не показывать хорошие результаты тестов, таких как статические стержней и брусьях (личные наблюдения), они кажутся менее хорошо скоординированы, чем мыши. Я только проверил самцов крыс, однако, и самцов мышей, кажется правило, менее хорошо скоординированы, чем женщины. Мыши, кажется, имеют более высокую прочность: весовом соотношении, чем крысы, латинское название, Mus мышцы, кажется вполне уместным. Rotarod, изменения стопы тест неисправности ¹² или подиуме (Noldus) ¹⁵ аппаратов, как правило, используются для оценки координации движений у крыс.

Introduction

Поведение проявляется действием, и действие требует моторных навыков, включая координацию тела. Один из первых экспериментов в истории поведения животных была выполнена Колин Стюарт, докторант в университете Кларка в США ^11. Он измерил активность крыс, помещая их в барабан и подсчитывали, сколько раз он обернулся. Эта ранняя аппарат был, вероятно, предтеча ходовых колес и в настоящее время используется Rotarod теста, хотя в аппарате Стюарт крысу внутри барабана, движение которого было обусловлено крысы, тогда как в Rotarod животное ходит на внешней стороне вращающийся барабан или стержень, с приводом от двигателя.

Оригинальный стержень используется Данхэм и Мия (1957) ⁷ был набор скорости, но в настоящее время ускорение версии (Джонс и Робертс 1968) ⁹ имеются. Недостатком установить скорость Rotarod том, что некоторые животные с плохой координацией упадет насамого начала, в то время как для тех, которые остаются на, тест скоро начнете измерять выносливость, чем их координация как таковой. Полученное бимодальное распределение точек данных может быть достаточно ненормальный, чтобы исключить параметрического анализа. При ускорении Rotarod используется, в частности, если она ускоряется только тогда, когда набор критериев, таких как пребывание в течение 10 сек, достигается, распределение данных, скорее всего, будет гауссовым. Ускорением можно отрегулировать так, что двигатель усталости не играет значительную роль в производительности; мышь вряд ли будет заметно усталости после всего 2-3 мин времени на Rotarod.

"Тестовой строки" ¹ ", вешалка Испытание" или турник меры передних конечностей силу и координацию. Два цитирует эпитеты относятся к ее развитию; первоначально строка была использована, но авторы отметили, что производительность зависит очень много о том, как тугие струны было, следовательно, будущие экспериментаторы использовали металлический стержень, часто вешалку. Мы обнаружили, что способность мыши для захвата бар обратно пропорциональна его диаметра, и стандартно использовали 2 мм бар. В гири (см. протокол Юпитер "Измеритель прочности мышей") очень тонкой проволоки из чайника мех / масштабе коллектора позволяет сильнейших животных по обеспечению такого хорошего сцепления, что они могут поднять больше, чем их собственный вес тела. Однако, при использовании большего диаметра горизонтальных полос может быть преимуществом, так как чувствительность теста улучшается, и лишь 2 мм бар большинстве нормальных мышей C57BL / 6 достигать потолка производительности. Таким образом, мы недавно приняла три-бар аппарата; стержни могут быть легко взаимозаменяемыми, поскольку они укладываются в надрезами в вершинах опорных колонн. Барах проводятся под напряжением (особенно важно, чтобы сделать 2 мм бар жесткая), поскольку они подходят только пазы, когда опоры немного сближены (как лука и его строка) (см. Рисунок 3).

Статические стержни или балки часто используетсяДля измерения координации, но дополнительная мотивация всегда использовалась, чтобы убедить животных пройти стержня. Они провели переговоры горизонтальную балку, чтобы достичь желаемой цели, такие, как дома клетке, убежище от яркого света или пищи (если они были сделаны голодный). Однако в ходе расследования этого типа испытания, я обнаружил, что мыши спонтанно развернуться при размещении на "открытые" концы консольных стержней, а затем пройти через него, пока они не достигли конца поддерживали. Этот метод устраняет необходимость обучения (необходимо в ранее упомянутых вариантов теста), как врожденные реакции мыши устанавливают у конца стержня повышенных является попытка достичь поддерживается конца. Это не значит, конечно, устранить проблему, что мотивационные изменения могут повлиять на производительность, которая всегда есть возможность с этим типом процедуры.

Картонные туннели в настоящее время часто используются для дома клетку обогащения среды, но их disadзрения в данном контексте является то, что животные неизбежно будет осуществлено в балансирование на цилиндры, которые могут колебаться вокруг своей длинной оси, имитируя навыки, необходимые для балансировать на Rotarod. Таким образом, обогащение доме клетку потенциально может маскировать поведенческих фенотипа; примером является улучшение ситуации с болезнями фенотипа Хантингтона обогащением ^14. Также животные часто ходить вдоль длинной оси из этих туннелей, а при хождении по повышенным статическим луч. Поэтому я построил пару повышенных брусья, и поместили мышей в середине с передними лапами на одном баре и hindpaws с другой стороны, ситуация которых они никогда бы не сталкивались прежде. Мыши были дойти до конца опоры брусьях, оставаясь при вертикальном положении, чтобы пройти тест. Нечто подобное устройство было ряд параллельных стержней, размещенных в мышиной клетке, чтобы оценить развитие скрепи индуцированного моторной дисфункции ^13.

Мы уже протестировали несколько сотенмышей моторных функций, в Оксфорде. Эти получили различные процедуры, включая фармакологические средства или пассивный перенос ткани (плазмы) от людей, но в основном генетически модифицированных животных. Некоторые животные были более обесцененные на прочность, чем координационных задач, другие наоборот. Некоторые мыши были более обесцененные на Rotarod чем на статических субстратов, таких как статические стержней и брусья, другие наоборот. Так что настоящей статье и сопровождающих протокол Юпитер "Измерение силы у мышей") описывает, каким образом характеризовать как различные процедуры и мутации могут по-разному влиять двигательной функции у мышей. Помимо Rotarod устройство, описанное здесь простой, дешевый и особенно подходит для лабораторий не специализированный для тестирования моторики. Для мелкомасштабных анализа походки, система Catwalk является гораздо более сложная система, чем старые методы, такие как убедить мышь, чтобы пройти через чернил ванну, а затем вниз лист бумаги, но это дорэлектронной части аппарата.

Все эти тесты предназначены для измерения координации, а не силу, хотя очевидно, что в минимальной степени мышечного тонуса нужно просто для мыши использовать его конечностей. Для оценки прочности, перевернутый процедуру экрана ¹⁰ больше подходит, или, если более градуированный требуется измерение, гирь или ее автоматизированной штрих-тянуть эквивалента (описано в протоколе Юпитер "Измерение силы у мышей»). Исключением является горизонтальной испытательного стержня, которая требует не только силы и координации для успешного выступления.

Protocol

1. Аппарат

Для всех тестов, проложенная мягкая поверхность помещается в основание аппарата, чтобы смягчить любой мышей, которые падают. NB Это не показано на чертежах, для того, чтобы не затемнять любой части аппарата. Во время тестирования сотен мышей, как нормальные, так и мутантные, мы никогда не наблюдали любой ущерб, причиненный при падении с такой аппарат, который, как правило, 30-50 см в высоту. Также убедитесь, что для очистки и стерилизации оборудования между каждой мыши испытания.

1,1 Rotarod

Есть несколько коммерческих версий этого аппарата на рынке, но некоторые имеют недостатки, такие как не ускоряться с адекватной скоростью для обнаружения транспортных нарушение координации (а не выносливость). Другим общим недостатком является то, что стержень не достаточно высоко над базой, в результате чего у мышей тенденцию падать или спрыгнуть.

Rotarod показано на рисунке 1 был сделан на дизайнавтором инженерным разделам кафедры фармакологии Оксфордского университета. Стержень диаметром 3 см, при поддержке 30 см над основанием аппарата. Поверхность накаткой в серии параллельных гребней вдоль продольной оси, что позволяет мышей, чтобы захватить ее эффективно (рис. 2). NB глубине хребтов является жизненно важным деталям; если мышь не может получить хорошее сцепление тест будет очень трудно, а с другой стороны, если власть слишком хорошо мышь "колесом" вокруг стержня пассивно держа к ней. Для "любительской производители Rotarod" это может быть полезно знать, что рифленой деревянной шпонками соответствующего размера для мышей является коммерчески доступным, это было бы, конечно, нужно относиться с хорошим водонепроницаемым лаком перед использованием. Начальная скорость доводят до 4 оборотов в минуту, ускорение скорости до 20 об / мин. Максимальная скорость составляет 40 оборотов в минуту.

Два фланца предотвратить мышь покидать стержня. Они составляют 30 см в диаметре (это, вероятно, может быть уменьшена до 20 см). Их разделение устанавливается на 6 см (максимум), но, возможно, должны быть скорректированы меньшего к югу от взрослых мышей, если они, как правило, оборачиваются на стержне.

1.2 Трехместный турниках (рис. 3)

Бруски изготовлены из латуни, 38 см в длину, состоявшемся 49 см выше поверхности скамьи по деревянной опорной стойки на каждом конце. Колонны крепятся к тяжелым деревянное основание. Трех диаметров баре имеются: 2, 4 и 6 мм. 2 мм бар является стандартной мы используем, но многие мышам достичь максимальной оценки по этому вопросу. Поэтому больше прутков диаметром были включены в попытке усовершенствовать теста, как мыши не может захватить эти так хорошо.

1.3 Статические стержней

Пять деревянных дюбелей или стержней различной толщины (35 (стержень 1), 28, 22, 15 и 9 (стержень 5) мм в диаметре), каждый длиной 60 см устанавливаются G-хомут в лабораторию полке так, что стержни выступают горизонтально в пространство (рис. 4). Конецстержня рядом со скамейкой имеет отметку 10 см от конца, чтобы обозначить линию финиша. Высота стержней над уровнем пола 60 см.

Если короче и менее подробный тест, необходимо использовать только самые крупные, маленьких и средних стержней. Ван Dellen соавт. ¹⁴ используется только один стержень для оценки прогресса болезни Хантингтона у мышей.

1.4 Параллельные брусья

Две параллельные брусья стали 1 м в длину и 4 мм в диаметре зафиксированы 30 мм (на их центры) друг от друга деревянные опорные столбы на их концах (рис. 5). Бары 60 см от пола.

2. Процедура

Для всех тестов принести мышей экспериментальной комнате 5-20 мин до начала испытания, чтобы убедиться, что они полностью проснулся. Как правило, чтобы позволить восстановление мышечной силы и возвращение к нормальному уровню возбуждения, отдохнуть мышей Вернуться на домашнюю клетку после каждого испытания двигателя. </ P>

2.1 Rotarod

Установите Rotarod с начала скоростью 4 RPM, ускорение скорости 20 об / мин. Удерживая кнопку мыши за хвост, и поместить его на вращающемся стержне, обращенной в сторону от направления вращения поэтому он должен идти вперед, чтобы оставаться в вертикальном положении. Проще всего это сделать, если мышь доводится до по отношению к стержню под углом 45 градусов ниже горизонтали; попытке снизить мыши сверху приведет к его распространение задних лапах и захвата краев фланцев. Быстро отпустите кнопку мыши, когда она почти касаясь стержня, только вперед и выше стержней верхней мертвой точке, что позволяет ему легко захватить стержня. (Вероятно, более простой и надежный) метод состоит в использовании тонкой (10-15 мм) шпунта. Удерживая кнопку мыши в одни руки, опустите его на дюбеля, параллельно длинной оси. Дюбель под углом с головой мыши вниз примерно на 30 °, чтобы дать ему больше времени, чтобы захватить Rotarod, когда он будет выпущен. Опустите мыши и дюбеля между гоэлектронной фланцы Rotarod, и как только на вращающемся стержне тянуть вниз дюбель от мыши, которая будет Возьмите стержень и идти вперед.

На 10 сек после размещения мыши на стержне, начать разгон (до тех пор, как мышь направлен вперед, а если нет, подождите, пока он делает лицом вперед до начала ускорения), и обратите внимание на скорость, с которой мышь отваливается. Если она падает до 10 сек, обратите внимание на время падения и попробуйте еще раз, до трех раз в общей сложности, регистрирующие скорость, на первое падение после 10 сек точки. Тем не менее, падает до 5 сек которые из-за плохого размещения экспериментатором не должны быть записаны. Средняя скорость падения опорной точки, а, скорее, чем при использовании максимальной скорости, это корректирует дополнительной практики мыши получает во время неудачного трассы, которой предполагается, будет способствовать производительности. Таким образом, мышь, которая падает до 10 секунд один раз, затем остается на до 12 оборотов в минуту второй оценки времени (4 +12) / 2 = 8 оборотов в минуту. Мыши два раза а затем падениепребывание на оборотах в минуту в течение 10 баллов (4 +4 +10) / 3 = 6 оборотов в минуту. Если мышь не в состоянии сцепления на 10 секунд три раза назначить его счет 4 оборотов в минуту.

Одной из проблем является то, что мышей иногда останавливаются идти вперед и возьмитесь за стержень, а не твердо, так что они пассивно сальто круглый, хотя большинство в конечном счете упасть. Поэтому было бы полезно также обратить внимание на скорость, когда первая такая инверсия. Возможным решением может быть использование стержня с большим диаметром или менее выраженный хребтов.

2,2 Турники

Как мыши, проще всего понять узкой 2 мм бар, желательно, чтобы проверить их в первую очередь на это. Удерживая кнопку мыши за хвост, поместите его на скамейке в передней части аппарата, он быстро скользит назад приблизительно на 20 см (это выравнивает его перпендикулярно к бару), быстрого повышения его и дайте ему понять турник в центральной точке с Только передними лапами, и отпустить хвост, одновременно начиная StopClock. Это струдно достичь эффективной; некоторые мыши сцепление лучше, если хвост сбрасывается резко, если они чувствуют, что они по-прежнему поддерживаются они могут не захват. Точка критерием является либо падение из бара до мыши достигает одного конца колонки бар, или время, пока одна лапка соприкасается колонки. Максимальное время теста (время отключения) не более 30 сек.

Если мышь не понимает баре правильно первый раз, и это, кажется, связано с техникой экспериментатора, а не мышь, попробуйте еще раз (после краткого отдыха, а другой один или два мышей испытывают) и не записывать эту осень. Если мышь падает до 5 сек, и это явно не из-за плохого размещения экспериментатором, повторяют до трех раз в попытке получить> 5 секунд счет. Если> 5 сек со второй попытки, не делай третье судебное разбирательство. Возьмите лучший результат как данное. Мышь, которая неоднократно не поддерживать себя в течение> 5 баллов только 1 сек.

Если тройка-бар версия используется, если мышь баллы 5 на этой первой 2 мм бар он может быть протестирован на толстые бары, после краткого периода отдыха, а другой один или два мышей испытывают. Система подсчета очков для 4 и 6 баров мм такая же, как для 2 мм бар, а окончательный счет является суммарный общий. Таким образом, мышь, что оценки на 5 мм 2 бара, но падает с 4 мм бар после 13 баллов с 5 +3 = 8.

2.2.1

Забив горизонтальных полос: первые два интервалом менее чем две последние как раз мышей первоначально освоили задачу они имеют меньше шансов упасть:
Падение между 1-5 сек = 1
Падение между 6-10 сек = 2
Падение между 11-20 сек = 3
Падение в возрасте 21-30 сек = 4
Падение после 30 сек = 5
Размещение одной передней лапой на опорную планку без падения = 5

NB как факультативного использования 4 и 6 мм баров является новым дополнением к нашему протоколу мы еще не имеют большойопыт работы с ними.

2.3 Статистические стержней

Наведите в дальнем конце самого широкого стержня (длина кончика носа одна голова с конца идеально). Возьмите две меры: ориентация времени (время, затраченное на ориентировать 180 ° от исходного положения к полке) и транзитного времени (время, необходимое для поездки в конце полки (нос за пределы 10 см знаком с полки конце стержня).

Ориентация зависит от мыши пребывание вертикально, если он переворачивается и держится ниже стержня, произвольно назначать его (для статистических целей) максимальный балл ориентации 120 сек. Не проверяйте его на меньшие стержни; также транзитное время становится максимальным значением, как мышь, которая проходит вертикально, очевидно, лучше, чем одному координируется которое занимается транзитом, вися вверх тормашками.

Если после ориентации, мышь падает или не будет достигнуто максимальное время теста (установленного на 120 секунд) не проверить его на сМаллер стержней. Для статистических целей Связать мышей падения назначены 120 для этого конкретного стержня и для последующих, так как предполагается, что они снова падают с узким стержнем. Если мышь переворачивается, также отмечают это событие, для успешного транзита, а также ориентацию, он должен оставаться в вертикальном положении на стержне. В противном случае присвоить ему максимальное количество баллов. Удалить мыши по достижении конца стержня или падений.

После тестирования на одном стержне вернуть мышь в клетке дома, чтобы отдохнуть во время проверки другой мыши. Затем поместите его на следующий меньший размер стержня и проверить его таким же образом снова. Остановить тестирование, если мышь падает стержня после того, на нем в течение более 5 сек. Если он упал менее чем за 5 сек заменить его и дать еще одну попытку (как падение в течение 5 секунд может быть связано с неисправным размещение экспериментатором), в течение максимум трех испытаниях, использовать лучший результат.

2.4 Параллельные брусья

Наведите в тОн центре два бара с его продольной оси, перпендикулярной, что из баров, обе передние лапы должны быть на одном баре, обе задние лапы на другой бар. Счет аналогична для статического стержней. Возьмем две меры: время, потраченное пока мышь не ориентирует 90 ° в исходное положение, и время, пока оно не достигнет впоследствии одной из концевых опор. Если мышь переворачивается, также отмечают это событие. Что касается статических тестов стержней, ориентации и пути должно быть достигнута без выворачивания наизнанку, в противном случае максимальное время отводится. Это редкий для разумно здоровых мышей падать менее чем за 5 сек, а если это произойдет это, вероятно, из-за плохого размещения. Поэтому отказаться от результата и перепроверять мыши.

Representative Results

Ожидаемые результаты

Статического стержня первоначально использовался для наблюдения за ходом болезни Хантингтона у мутантных мышей, с или без обогащения среды в их доме клетках ^14. Программу обогащения резко задерживается наступление моторной дисфункции на стержне, который сопровождался задержка начала задних лап сжимая, общий признак неврологических нарушений.

Скрепи-инфицированных мышей показали снижение производительности горизонтальный бар с 16 недели после инъекции, в Rotarod тестирования с недели 18 и статические стержней из по крайней мере неделю 19 ⁸ (ранее тестирование не проводилось). КАТП канала субъединицы Kir6.2 KO мышей были нарушены на статические стержней и турник, но не на Rotarod ^4. Поражениях гиппокампа не влияет на любую меру способности двигателя ^5, но 129S2/Sv мышей хуже, по сравнению с C57BL / 6 нагрузку на Rotarod и статические стержней ^3. С57ВЛ/10 мышей также было хуже, чем двигательной активности мышей C57BL / 6 ^6, хотя и не в такой же степени, как мыши 129S2/Sv.

Рисунок 1. Rotarod.

Рисунок 2. Деталь накатанной жезл Rotarod.

Рисунок 3. Трехместный турники баре состоялась в пазы является основным 2 мм один;. Прикрепил под ним (только для демонстрационных целей) являются 4 и 6 мм баров. На практике, только один бар, в то время, прорезана в зубчатым опор.

Рисунок 4. Перемещения мыши статический стержня.

Рисунок 5. Мыши на брусьях. Заполнение было опущено только для демонстрационных целей.