Mätning motorisk koordination hos möss

Summary

Protokoll presenteras för två etablerade uppgifter motorik, den accelererande rotarod och horisontella bar, även två tester som utvecklats i Oxford Nyligen statiska stavar och barr. Dessa tester kan upptäcka motoriska funktionsnedsättningar potentiellt intressanta i sin egen rätt, samt är möjliga variabler i tester i andra områden av beteenden.

Abstract

Möss används alltmer i Behavioral Neuroscience, till stor del ersätter råttor som beteendevetare s valda djuret. Innan aspekter av beteende såsom emotionalitet eller kognition kan bedömas, däremot, är det viktigt att avgöra om de motoriska funktionerna i t.ex. en mutant eller skadade musen göra en sådan bedömning. Prestanda på en labyrint uppgift som kräver styrka och samordning, exempelvis Morris water maze, kan mycket väl vara nedsatt hos en mus av motor, i stället för kognitiva, försämringar, så det är nödvändigt att selektivt dissekera den senare från den förra. Till exempel, orsakade sensorimotor nedskrivningar av NMDA-antagonister har visat sig försämra prestandan vatten labyrint ^2.

Motorik har traditionellt studerats på mus och råtta vid rotarodtestet, där djuret placeras på en horisontell stång som roterar kring sin längdaxel, djuret måste gå framåt för att hålla sig upprätt och inte falla av.Både inställda hastigheten och accelererande versioner av rotarod är tillgängliga.

De övriga tre provningar som beskrivs i den här artikeln (horisontella fältet, statiska stavar och parallella barer) alla mått samordning statisk apparat. Det horisontella fältet kräver också styrka för tillräcklig prestanda, särskilt i frambenen som musen inledningsvis griper bar bara med framtassarna.

Vuxna råttor presterar inte bra på test liksom de statiska stavar och barr (personliga observationer), de verkar mindre väl samordnade än möss. Jag har bara testat hanråttor, dock, och hanmöss verkar i allmänhet mindre väl samordnade än honorna. Möss verkar ha en högre hållfasthet: viktförhållande än råttor, det latinska namnet, Mus musculus, verkar helt lämpligt. The rotarod, har variationerna av foten felet testet ¹² eller Catwalk (Noldus) ¹⁵ apparat i allmänhet för att utvärdera motorisk koordination hos råttor.

Introduction

Beteende görs manifesteras genom handling, och handling kräver motorik, inklusive samordning av kroppen. En av de första försöken i historien om djurs beteende utfördes av Colin Stewart, en doktorand vid Clark University i USA ^11. Han mätte aktiviteten hos råttor genom att sätta dem i en trumma och räknade antalet gånger det vände. Denna tidiga apparat var förmodligen föregångaren till rinnande hjul och för närvarande används rotarodtestet, om än i Stewart apparaten råttan var inuti trumman, vars rörelse drevs av råttan, medan i rotarod djuret går på utsidan av en roterande trumma eller stång som är motordriven.

Den ursprungliga staven används av Dunham och Miya (1957) ⁷ hade en inställd hastighet, men numera accelererande versioner (Jones och Roberts 1968) ⁹ finns tillgängliga. Nackdelen med en inställd hastighet rotarod är att vissa djur med dålig samordning kommer att falla bort vidbörjan, medan för dem som vill bo på, kommer testet snart börja mäta uthållighet snarare än samordning per se. Den resulterande bimodal fördelning av datapunkter kan vara tillräckligt avvikande för att utesluta parametrisk analys. När en accelererande rotarod används, särskilt om det accelereras endast när en uppsättning kriterier, som vistas på under 10 sekunder, uppnås, är datadistribution mer sannolikt Gauss. Den acceleration kan ställas in så att motorn trötthet inte spelar en viktig roll i prestanda, en mus är sannolikt inte påtagligt trött efter bara 2-3 min tid på rotarod.

Den "string test" ^1, "klädhängare test" eller horisontella fältet mäter framben styrka och koordination. De två citerade epitet hänvisa till dess utveckling, ursprungligen en sträng användes, men författarna noterade att resultatet berodde mycket på hur spända strängen var, därmed framtida praktiker använde en metall bar, ofta en klädhängare. Vi har funnit att en mus förmåga att gripa stången är omvänt proportionell mot dess diameter, och har standardmässigt använt en 2 mm bar. I vikter testet (se JUPITER-protokollet "att mäta styrkan hos möss") mycket fin tråd av en vattenkokare päls / skala samlare låter de starkaste djuren att säkra en så bra grepp som de kan lyfta mer än sin egen kroppsvikt. Dock kan använda större diameter horisontella staplar vara en fördel eftersom känsligheten hos testet förbättrar, med endast en 2 mm bar mest normala C57BL / 6 möss når taket prestanda. Därför har vi nyligen antagit en tre-bar apparater, barer kan lätt bytas eftersom de passar in i skåror skurna i topparna av stödpelare. Stängerna hålls under spänning (särskilt viktigt att göra 2 mm bar stel), eftersom de endast passar i skårorna när stöden något dras ihop (som en pilbåge och dess string) (se figur 3).

Statiska stänger eller balkar har ofta använtsatt mäta samordning, men extra motivation var alltid använts för att övertyga djuren att korsa stången. De förhandlade en horisontell balk för att nå ett önskat mål, såsom buren, tillflykt från ett starkt ljus, eller mat (om de har gjorts hungrig). Men i samband med utredningen av denna typ av test, upptäckte jag att möss spontant skulle vända när de placeras på "öppna" änden av en fribärande stav, och sedan korsa den tills de nådde stöds slutet. Denna teknik eliminerar behovet av utbildning (nödvändig i de tidigare nämnda testvarianter) som den medfödda reaktionen av en mus för att placeras nära änden av en upphöjd stav är att försöka uppnå den uppburna änden. Detta inte, naturligtvis, eliminera problemet som motiverande förändringar kan påverka prestanda, är som alltid en möjlighet med denna typ av förfarande.

Kartong tunnlar för närvarande mycket för hemmet buren miljöberikning, men deras underlägeutsiktspunkt i detta sammanhang är att djuren oundvikligen kommer att praktiseras i balanserar på cylindrar som kan vingla omkring sin längdaxel, härma de färdigheter som krävs för att balansera på rotarod. Således buren anrikning skulle kunna maskera en beteendevetenskaplig fenotyp, ett exempel är förbättring av en Huntingtons sjukdom fenotyp genom anrikning ^14. Också djuren vandrar ofta längs den långa axeln av dessa tunnlar, som när man går längs en förhöjd statisk balk. Därför konstruerade jag ett par förhöjda parallella barer, och placerades mössen i mitten med framtassarna på en bar och baktassarna på andra, en situation som de aldrig skulle ha stött på tidigare. Möss fick nå slutet stöder i barren medan resterande upprätt för att klara provet. En något liknande anordning var en serie av parallella stänger placerade i en mus bur för att bedöma utvecklingen av scrapie-inducerad motorisk dysfunktion ^13.

Vi har nu testat flera hundramöss för motorik i Oxford. Dessa hade fått olika behandlingar inklusive farmakologiska medel, eller passiv överföring av vävnad (plasma) från människor, men mestadels genetiskt modifierade djur. Vissa djur var mer osäkra på styrka än samordningsuppgifter, andra vice versa. Vissa möss var mer osäkra på rotarod än den statiska substrat såsom de statiska stavar och parallella barer, andra vice versa. Så denna artikel och medföljande JUPITER-protokollet "Att mäta styrkan hos möss") beskriver hur man karakterisera hur olika behandlingar och mutationer kan differentiellt påverkar motoriken hos möss. Bortsett från rotarod den apparat som beskrivs här är enkel, billig och särskilt lämplig för laboratorier inte specialiserade för att testa motorik. För finskalig gånganalys är Catwalk systemet ett mycket mer sofistikerat system än äldre metoder som att förmå en mus för att gå igenom ett bläck bad och sedan ned ett papper, men det är en expensive apparat.

Alla dessa tester är utformade för att mäta koordination snarare än styrka, även om naturligtvis en minimal grad av muskelspänning är nödvändigt bara för musen för att använda sina armar och ben. För styrka bedömning, är den inverterade skärmen proceduren ¹⁰ mer passande, eller, om en mer graderad mätningar krävs, de vikter test eller dess automatiserade bar-pull motsvarande (beskriven i JUPITER-protokollet "Att mäta styrkan hos möss"). Undantaget är den horisontella linjen testet, vilket kräver både styrka och koordination för att lyckas.

Protocol

Ett. Apparat

För alla tester, är en mjuk vadderad yta placerad vid basen av apparaten för att dämpa eventuella möss som faller av. NB Detta är inte visat i figurerna, för att inte skymma någon del av anordningen. Under testningen av hundratals möss, både normala och muterade, har vi observerat aldrig någon skada genom att falla från en sådan apparat, vilket är typiskt 30-50 cm hög. Var också noga med att rengöra och sterilisera utrustningen mellan varje testad mus.

1,1 Rotarod

Det finns flera kommersiella versioner av denna apparat på marknaden, men vissa har nackdelar, till exempel att inte accelerera på ett adekvat hastighet för att detektera motor koordinationssvårigheter (snarare än uthållighet). Ett annat vanligt fel är att staven inte är tillräckligt hög ovanför basen, vilket resulterar i möss som tenderar att tappa eller hoppa av.

Den rotarod visas i figur 1 gjordes till designenav författaren av tekniska delar av avdelningen för farmakologi, University of Oxford. Staven är 3 cm i diameter, med stöd 30 cm ovanför basen av anordningen. Ytan är rafflad i en serie av parallella åsar utmed den längsgående axeln, gör det möjligt för mössen att greppa den effektivt (Figur 2). NB Djupet av åsarna är en viktig detalj, om musen inte kan få ett bra grepp testet kommer att bli mycket svårare, men å andra sidan, om greppet är för bra Musen "cartwheel" runt stången genom att passivt hålla på det. För "amatör Rotarod beslutsfattare" kan det vara bra att veta att räfflade trä Dymling av lämplig storlek för möss är kommersiellt tillgänglig, det skulle naturligtvis behöva behandlas med en bra vattentät lack före användning. Starten hastighet justeras till 4 varv per minut, den acceleration till 20 varv / min. Maxhastigheten är 40 rpm.

Två flänsar hindrar musen från att lämna stången. De är 30 cm i diameter (dettaskulle förmodligen kunna minskas till 20 cm). Deras separation är satt till 6 cm (maximum), men kan behöva justeras mindre för sub-vuxna möss om de tenderar att vända på stången.

1.2 Triple horisontella stänger (Figur 3)

Stängerna är tillverkade av mässing, 38 cm lång, som hölls 49 cm över bänken ytan av ett trä stödpelare i varje ände. Kolumnerna är fästa vid en tunga trä bas. Tre stångdiametrar finns: 2, 4 och 6 mm. Den 2 mm bar är den standard som vi använder, men många möss nå maximal poäng på detta. Därför större diameter barer har införts i ett försök att förfina testet, som möss inte kan greppa dem så väl.

1.3 Statiska stavar

Fem träpinnar eller stavar av varierande tjocklek (35 (stång 1), 28, 22, 15 och 9 (stången 5) mm diameter) var 60 cm lång fastställs genom en G-klämma till ett laboratorium hylla så att stavarna vågrätt sticka i rymden (Figur 4). Slutetav stången nära bänken har ett märke 10 cm från slutet, för att beteckna mållinjen. Höjden av stavarna ovanför golvet är 60 cm.

Om en kortare och mindre detaljerad prov krävs, använd bara de största, minsta och mellersta stavar. Van Dellen et al. ¹⁴ användes endast en enda stav för att bedöma utvecklingen av Huntingtons sjukdom i möss.

1.4 barr

Två parallella stålstänger 1 m långa och 4 mm i diameter är fasta 30 mm (på sina centra) sönder av trä stödpelare i ändarna (Figur 5). Staplarna är 60 cm över golvet.

2. Procedur

För alla tester, ta möss till den experimentella rum 5-20 minuter före testning, för att säkerställa att de är fullt vaken. Som en allmän regel, att tillåta återhämtning av muskelkraft och en återgång till normala nivåer av upphetsning, vila möss genom en återgång till hemmet buren efter varje motor test. </ P>

2,1 Rotarod

Ställ rotarod med en start hastighet av 4 varv, acceleration 20 varv / min. Håll musen i svansen, och placera den på den roterande staven, vänd bort från rotationsriktningen så det måste gå framåt för att hålla sig upprätt. Detta är lättast att göra om musen förs upp mot staven i en vinkel av 45 ° under horisontalplanet, försöker sänka musen från ovan kommer att resultera i att det sprider sina bakben och gripa kanterna på flänsarna. Snabbt på musen när den nästan vidrör stången, precis framför och ovanför stavarna övre dödläget, som gör det möjligt att enkelt greppa staven. En (förmodligen enklare och mer tillförlitlig) metod är att använda en tunn (10-15 mm) plugg. Håll musen i ena handen, sänk den till pluggen, parallellt med den långa axeln. Pluggen är vinklad med musens huvud nedåt ca 30 ° för att ge det mer tid att greppa rotarod när den släpps. Sänk musen och träpinne mellan the flänsar rotarod, och en gång över det roterande stav dra pluggen nedåt bort från mus, vilket kommer att ta tag i stången och gå framåt.

På 10 sekunder efter att placera musen på stången, börja acceleration (så länge musen är vänd framåt: Om inte, vänta tills det gör ansiktet framåt innan acceleration), och notera vilken hastighet musen faller av. Om det faller av innan 10 sekunder, notera tiden för hösten och försöka igen, upp till tre gånger totalt, registrering av hastighet vid den första nedgången efter 10 sek punkten. Dock infaller före 5 sek som beror på dålig placering av försöksledaren bör inte registreras. Den genomsnittliga hastigheten på hösten är utgångspunkten, istället för att använda den maximala hastigheten, korrigerar detta för extra träning musen erhåller under det misslyckade körningar, där det antas skulle hjälpa prestanda. Alltså en mus som infaller före den 10 sec gång sedan stannar på till 12 rpm andra gången poäng (4 +12) / 2 = 8 rpm. En mus faller dubbelt såvistas på för 10 rpm poäng (4 +4 +10) / 3 = 6 rpm. Om en mus inte grepp i 10 sek tre gånger tilldela den en poäng av 4 rpm.

Ett problem är att möss ibland sluta gå framåt och gripa stången ordentligt istället, så att de passivt kullerbytta rund, även om de flesta så småningom faller av. Det kan därför vara lämpligt att också notera hastigheten när den första inversion uppstår. En möjlig lösning kan vara att använda en stav med en större diameter eller mindre uttalade åsar.

2.2 Horisontella staplar

Eftersom möss tycker det är lättast att förstå den smala 2 mm bar, är det lämpligt att testa dem först på den här. Håll musen i svansen, placera den på bänken framför apparaten, dra det snabbt bakåt ca 20 cm (detta anpassar den vinkelrätt mot stången), snabbt upp den och låt den ta tag i horisontella fältet vid den centrala punkten med dess framtassarna bara, och släppa svansen, samtidigt startar stopclock. Denna cen vara svårt att uppnå ett effektivt, några möss greppet bättre om svansen släpps plötsligt, om de känner att de fortfarande stöds kan de misslyckas med att greppa. Kriteriet punkten är antingen en nedgång från baren innan musen når ett av änd kolumner i baren, eller tiden tills en framtassarna vidrör en kolumn. Maximal testtid (cut-off tid) är 30 sek.

Om musen inte förstå ribban ordentligt första gången och det verkar vara hänförligt till försöksledaren s teknik, i stället för mus, försök igen (efter en kort vila medan ytterligare en eller två möss testas) och inte spela i höst. Om musen infaller före 5 sek och detta är uppenbarligen inte på dålig placering av försöksledaren, upprepa upp till tre gånger i ett försök att få en> 5 sek poäng. Om> 5 sek på andra försöket, gör inte en tredje rättegång. Ta den bästa poängen som utgångspunkt. En mus som upprepade gånger misslyckas med att stödja sig på> 5 sek poäng endast 1.

Om triple-bar version används, om musen betygsättning 5 på denna första 2 mm bar det kan sedan testas på tjockare barer, efter en kort viloperiod medan ytterligare en eller två möss testas. Det poängsystem för 4 och 6 mm barer är samma som för 2 mm bar, och slutresultatet är det ackumulerade totala. Alltså en mus som gör mål 5 om 2 mm bar men faller från 4 mm bar efter 13 sek betygsättning 5 +3 = 8.

2.2.1

Scoring de horisontella staplar: de två första intervallen är mindre än de två sista som en gång mössen har initialt behärskar den uppgift de är mindre benägna att falla:
Falling mellan 1-5 sek = 1
Falling mellan 6-10 sek = 2
Falling mellan 11-20 sek = 3
Falling mellan 21-30 sek = 4
Falling efter 30 sek = 5
Placera en framtassarna på en bar stöd utan att falla = 5

NB som frivillig användning av 4 och 6 mm barer är ett nytt tillskott till våra protokoll vi ännu inte har omfattandeerfarenhet av dem.

2,3 Statiska stavar

Placera musen vid den bortre änden av den bredaste stången (nosspetsen en huvudets längd från slutet är perfekt). Ta två åtgärder: orientering time (tid det tar att orientera 180 ° från startpositionen mot hyllan) och transit tid (den tid det tar att resa till hyllan änden (näsa förbi 10 cm märket från hyllan änden av stången).

Orientering är beroende av musen vistas upprätt, om det vänder upp och ner och fastnar under stången, godtyckligt tilldela den (för statistiska ändamål) den maximala orienteringen poäng av 120 sek. Testa inte det på mindre stavar, även övergångstiden blir det maximala värdet som en mus som transiterar upprätt uppenbarligen samordnas bättre än en som transiterar medan hängande på upp och ned.

Om, efter orientering, faller musen eller den når den maximala testtiden (godtyckligt satt till 120 sek) inte testa den på sMALLER stavar. För statistiska ändamål är tilldela möss faller tilldelats 120 för just spö och för de därpå följande, eftersom det antas att de åter skulle falla från en smalare stav. Om musen vänder upp och ner, också notera denna händelse, för framgångsrik transitering samt orientering måste hålla sig upprätt på stången. Annars tilldela den maximala poängen. Ta musen när den når slutet av staven eller faller.

Efter att ha testat den ena staven tillbaka musen till buren för att vila medan du testar en annan mus. Placera den sedan på nästa mindre storlek spö och testa den på samma sätt igen. Stoppa testa om musen faller av en stav efter att ha varit på det i mer än 5 sek. Om det föll på mindre än 5 sekunder ersätta den och låta en annan försök (som faller inom 5 sekunder kan bero på felaktig placering av försöksledaren), för högst tre försök, och använda det bästa resultatet.

2.4 barr

Placera musen i tHan mitten av de två barerna med sin längdaxel vinkelrätt mot den av barerna, båda framtassarna ska vara på en bar, båda baktassarna på den andra baren. Scoring är liknande den för de statiska stavar. Ta två åtgärder: tiden tills musen orienterar 90 ° till startläge, och tiden tills den senare når en av slutet stöder. Om musen vänder upp och ner, också notera denna händelse. När det gäller de statiska stavar testet, orientering och transit måste uppnås utan att det blir upp och ner, annars den maximala tiden tilldelas. Det är sällsynt att någorlunda friska möss att falla på mindre än 5 sekunder, om detta händer är det förmodligen beror på dålig placering. Därför kassera resultat och testa musen.

Representative Results

Förväntat resultat

En statisk stav användes ursprungligen för att övervaka utvecklingen av Huntingtons sjukdom i muterade möss, med eller utan miljöberikning i deras hem burar ^14. Det program för anrikning försenade dramatiskt uppkomsten av motorisk dysfunktion på stången, vilket skedde parallellt med en fördröjning i starten av baktassen knäppa, en generell tecken på neurologisk försämring.

Scrapie-infekterade möss visade en minskning i horisontell stång prestanda från vecka 16 efter injektion, i rotarod tester från vecka 18, och statiska stavar från åtminstone vecka 19 ⁸ (tidigare tester utfördes inte). KATP kanal subenheten Kir6.2 KO möss nedsatt på de statiska stavar och horisontella fältet, men inte på rotarod ^4. Hippocampus lesioner hade ingen effekt på alla former av motorisk förmåga ^5, men 129S2/Sv möss nedsatt i förhållande till C57BL / 6 stam på rotarod och statiska stavar ^3. C57BL/10 möss hade också sämre motorprestanda än C57BL / 6 möss ^6, men inte i samma utsträckning som 129S2/Sv möss.

Figur 1. The rotarod.

Figur 2. Detalj av den räfflade stången i rotarod.

Figur 3. Den tredubbla horisontella staplar Baren hålls i skårorna är den grundläggande 2 mm en,. Uppsatt under den (endast för demonstrationssyfte) är 4 och 6 mm barer. I praktiken är endast en stapel i taget placeras in de skårade stöden.

Figur 4. En mus genomkorsar en statisk stång.

Figur 5. En mus på barren. Padding har utelämnats endast i demonstrationssyfte.