Summary
このビデオでは、我々は、培養神経細胞のためのマイクロ流体デバイスをfarbricateするために使用するポリジメチルシロキサン（PDMS）とソフトリソグラフィーの手法を示しています。
Abstract
このビデオでは、私たちは培養神経細胞のためのマイクロ流体デバイスを作製するために使用するポリジメチルシロキサン（PDMS）とソフトリソグラフィーの手法を示しています。以前は、シリコンウェハは、SU - 8とフォトリソグラフィーマスターの金型を作成するために、または何を我々は単に"マスター"として参照を使用してニューロンマイクロ流体デバイスの設計をパターン化した。次に、我々は、° Cで1時間80 PDMSを加熱することにより硬化されているマスターの上にシリコンポリマーPDMSを注ぐ。 PDMSは、デバイスの負の金型を形成している。 PDMSは、慎重にカットし、マスターから離れて持ち上げられる。穴は貯水池があるところ打ち抜き、過剰PDMSは、デバイスからトリムされます。窒素は装置から余分なゴミを吹き飛ばすために使用されます。この時点でデバイスを使用する準備が整いましたので、どちらもプラズマ滅菌器/クリーナーとコーニング第1カバーガラスに接着したり、可逆的に単にカバーガラスの上にデバイスを配置することにより、カバーガラスにバインドすることができます。ガラスへのデバイスの可逆的結合は、別のビデオで覆われ、デバイスは70％エタノールでまたはオートクレーブのいずれかによって滅菌される最初の必要です。それ以上の処置は必要ないので、プラズマの治療には、デバイスを滅菌する。それは、表面がまだ親水性である一方、プラズマ処理の10分以内にデバイスに液体を追加するデバイスを、プラズマが、治療時に、、しかし、重要です。デバイスに液体を追加する10分以上待つことが困難液体がデバイスを入力できるようになります。ニューロンデバイスは、通常のガラスとpH8.5のホウ酸緩衝液に0.5 mg / mlのポリ- L -リジン（PLL）をカバーするためにプラズマバインドされたが、すぐにデバイスに追加されます。 PLLでインキュベート3時間の最小値の後に、デバイスが各洗浄の間に少なくとも15分にdH2Oの水で最低3回洗浄する。次に、水は除去され、新鮮なメディアがデバイスに追加されます。この時点で、デバイスの使用準備ができています。デバイスからすべてのメディアを取り外すことは決してして、この時点で覚えておくことが重要です。常にメインチャネルのメディアを残す。
Protocol
パート1：マイクロ流体ニューロンデバイスの準備
- 3"フォトリソグラフィーによるSU - 8で作られたパターンを持つシリコンウェハは、ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ金型をキャストするために使用されます。我々は、マスター金型、またはSU - 8のパターニングシリコンウェハを参照して"マスター"。
- PDMSは10:1 AW / w比で硬化剤と混合され、PDMSの10グラムのために、すなわち、硬化剤の1グラムが追加されます。
- PDMSは、よく混合し、シリコンウエハ上に注がれています。シリコンウェハは、10cmのポリスチレンペトリ皿内に含まれています。それは約4mmの厚さでマスターをカバーするためにPDMSの約12グラム〜15 gを取ります。
- PDMSとマスターは、ペトリ皿の蓋付きの真空デシケーターに配置され、真空が適用されます。これは、硬化剤の中で撹拌中に導入されたPDMSから気泡を取り除くために行われている。それは、気泡のため約15分が削除されます。
- PDMSとマスターは、デシケーターから削除されます。 0.45 UMのフィルター付き空気銃は、残りの気泡を除去するために使用されます。
- マスターは、治すために1時間80℃のホットプレート上に配置されます。
注 ：真空デシケーターを使用できない場合は、マスターが数時間室温で放置することができます。気泡は、最終的に自分自身で消費されます。ホットプレートが使用できない場合は、PDMSは、24時間後に室温で硬化されます。
注 ：マスターは、硬化プロセス中レベルであることを確認することも重要です。
パート2：ニューロンマイクロ流体デバイスを切り出す
- PDMSはマスターに硬化されると、それはクリーンフードに取得されます。
- 外科ブレードを使用して、円はデバイスの周囲にカットされます。するときに一インサートPDMSにブレード、それはシリコンウエハとの接触を行うことがウエハ上にあまりにも多くの圧力をかけることが重要です、他のマスターは、割れの原因となる。
- 円で（各3あたり4デバイス"シリコンマスターが存在する）、PDMSは慎重にマスターリフトオフされデバイスの周りのすべての方法をカット。これは、前のカットに挿入されると優しく外科刃をねじることによって起動することができます。
- 次に、貯水池は、8 mmの組織生検パンチを使用してデバイスにパンチされています。
- デバイスは、四つと過剰PDMSデバイスがコーニングカバーガラス（1号）24ミリメートル× 40ミリメートルにきちんと収まるように離れてトリミングされます。窒素、空気が余分なゴミを吹き飛ばすために使用されます。頑固な残骸は、3Mスコッチブランド471ビニールテープを使用して削除できます。
パート3：プラズマボンディングガラスカバースリップのデバイス。
- プラズマクリーナーは、カバースリップに結合するHarrickニューロンデバイスを使用されています。簡単に言えば、デバイスは、プラズマクリーナーに配置され、真空ポンプは、チャンバから空気を排気するために使用されます。
- 真空圧力は300ミリトルに達した後、電源が電気コイルに電源が入っており、高に設定されています。
- -電気的なコイルは"電子、イオンと中性原子または分子から成る部分的にイオン化されたガス"、プラズマを作成しhttp://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php 、うち残っている空気分子のは、チャンバー内に残された。プラズマはガラスと永続的な結合を形成する一緒に置くとデバイスの表面に反応種を作成します。プラズマはまた、液体の付加を促進する助け親水性の表面を、になります。さらに、プラズマクリーナーは、デバイスを滅菌する。
マイクロ流体デバイスを含むPDMSデバイスの表面はガラスのスライドとともにプラズマクリーナーに表向きに置かれます。
ガラスとマイクロ流体デバイスの表面をプラズマ処理は、滅菌60 mmの培養ディッシュに入れ、クリーンベンチで互いに接触して組み立てられています。処理された表面は、タイトな不可逆的な結合を形成する。 - ガラスにデバイスを接合するプラズマの10分以内、ポリ- L -リジン（PLL）がデバイスに追加されます。 10分後、デバイスの親水性は、それが困難なPLLは、デバイスを入力できるようになっ減少します。
注 ：PLLの添加後、装置内の空気の泡をチェックすることが重要です。彼らは細胞を酸化と同じように、メインチャンネルでの気泡は、好ましくないです。あらゆる既存のAIRの気泡を除去する簡単な方法は、液体の150μlを（この場合は、PLL内）で満たされたP200ピペットを使用する場合、メインチャネルの開口部に直接先端を配置し、強制的にP200を押し下げる。これは繰り返すことが必要になることがありますが、最終的にはピペットからの力が気泡を追い出すでしょう。 - PLLを含むデバイスは、37標準組織培養インキュベーターで一晩インキュベートされている° C、5％のCO 2。
- 翌日、デ悪徳は、オートクレーブdH2Oで二回迅速にすすぎ洗いされています。このプロセスの間に、液体を完全にのみ貯水池から、メインチャンネルから削除されることはありません。メインチャンネルから液体を削除すると、泡をご紹介します。 2クイック洗浄した後、デバイスは、オートクレーブdH2Oを充填し、約3時間のインキュベーターに戻し入れ、または一晩されています。
- 翌日、デバイスが再度オートクレーブdH2Oで素早く2回リンスしています。その後、培養初代ラットの神経細胞のために必要なサプリメントB27とグルタミンを含む神経基本培地は、デバイスに追加されます。デバイスは、将来の使用のためにインキュベーターに戻って配置されます。デバイスは現在、神経細胞の播種のための準備が整いました。
Discussion
このビデオでは、デバイスは、私たちは細胞体、樹状突起、および軸索のミックスを含むコンパートメントからmicrogroovesで区切られた純粋な軸索の画分を得ることができますインチ我々は文化の神経細胞に使用するPDMSマイクロ流体デバイスを作成し、準備する方法を示している。これらのデバイスは、研究者が様々な治療の効果を研究するだけでなく、軸索上の物理的な傷害を実施し、これらの治療は、神経細胞にどのような効果を観察するためのプラットフォームを提供することができます。デバイスはまた、輸送の研究を促進支援する培養神経細胞にするためのレベルを提供します。さらに、軸索のコンパートメントから細胞培養のコンパートメントを分離microgroovesは、、それが可能な治療法と直接デバイスの反対側に影響を及ぼすことなく、デバイスの一方の側を治療することつの区画の間に流体を分離することができます。このプロパティは、研究者が治療の結果そのシグナル伝達や輸送などの効果を研究することができます。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you | |
| Plasam Cleaner | Tool | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Neural Basal Media | Reagent | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
| Cornig No. 1 Cover Glass | cover glass | Corning | Corning No. X2935 244 | Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D |
| 60 mm Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-13A | 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass. |
| BD Falcon 50 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A |
| BD Falcon 15 ml tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| Poly-L-Lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| New Item |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
