Biology

एक microfluidic डिवाइस के न्यूरॉन सोमा और axons की Compartmentalization निर्माण के लिए

Published: August 22, 2007 doi: 10.3791/261

Joseph Harris¹, Hyuna Lee¹, Behrad Vahidi¹, Christina Tu², David Cribbs³, Noo Li Jeon¹, Carl Cotman³

¹Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine (UCI), ²Stem Cell Research Center, University of California, Irvine (UCI), ³Institute for Brain Aging and Dementia, University of California, Irvine (UCI)

Summary

इस वीडियो में हम polydimethyl siloxane (PDMS) जो हम संवर्धन न्यूरॉन्स के लिए एक microfluidic युक्ति farbricate उपयोग के साथ नरम लिथोग्राफी की तकनीक का प्रदर्शन.

Abstract

इस वीडियो में, हम polydimethyl siloxane (PDMS) जो हम संवर्धन न्यूरॉन्स के लिए एक microfluidic युक्ति बनाना उपयोग के साथ नरम लिथोग्राफी की तकनीक का प्रदर्शन. इससे पहले, एक सिलिकॉन वफ़र न्यूरॉन microfluidic डिवाइस का उपयोग SU-8 और एक मास्टर मोल्ड बनाने photolithography, या हम क्या सिर्फ एक "मास्टर" के रूप में उल्लेख के लिए डिजाइन के साथ नमूनों था. अगला, हम मास्टर जो तब 80 PDMS हीटिंग डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए ठीक है के शीर्ष पर सिलिकॉन बहुलक PDMS डालना. PDMS डिवाइस के नकारात्मक मोल्ड रूपों. PDMS तो ध्यान से कट जाता है और मास्टर से दूर हटा लिया. छेद जहां जलाशयों जाएगा छिद्रित हैं और अतिरिक्त PDMS डिवाइस से दूर छंटनी. नाइट्रोजन डिवाइस से दूर किसी भी अतिरिक्त मलबे झटका करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस बिंदु पर उपकरणों अब इस्तेमाल के लिए तैयार कर रहे हैं और या तो / अजीवाणु बनानेवाला पदार्थ क्लीनर प्लाज्मा या reversibly बस कांच कवर के ऊपर डिवाइस पर रखकर किया जा सकता है कांच कवर करने के लिए बाध्य के साथ Corning नंबर 1 कवर कांच को बंधुआ कर सकते हैं. डिवाइस की प्रतिवर्ती कांच के संबंध में एक अलग वीडियो कवर किया जाता है और पहले की आवश्यकता है कि डिवाइस या तो 70% इथेनॉल के साथ या autoclaving द्वारा निष्फल हो. प्लाज्मा के इलाज के उपकरणों sterilizes तो कोई आगे के इलाज के लिए आवश्यक है. तथापि, यह महत्वपूर्ण है, जब डिवाइस, प्लाज्मा उपचार के 10 मिनट के भीतर उपकरणों के लिए तरल जोड़ने जबकि अभी भी सतहों हाइड्रोफिलिक हैं प्लाज्मा इलाज. 10 मिनट से अधिक लंबी प्रतीक्षा की जा रही डिवाइस के लिए तरल जोड़ने के तरल डिवाइस में प्रवेश करने के लिए यह मुश्किल के लिए बनाता है है. न्यूरॉन उपकरणों आम तौर पर कर रहे हैं प्लाज्मा कांच और पीएच 8.5 borate बफर में 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर पाली एल lysine (पीएलएल) को कवर ही सीमित तुरंत डिवाइस के लिए जोड़ा जाता है. PLL के साथ incubating तीन घंटे की एक न्यूनतम के बाद, उपकरणों dH2O पानी के साथ धो रहे हैं प्रत्येक धोने के बीच कम से कम 15 मिनट के साथ 3 बार की एक न्यूनतम. अगला, पानी निकाल दिया है और ताजा मीडिया डिवाइस के लिए जोड़ा जाता है. इस बिंदु पर डिवाइस के इस्तेमाल के लिए तैयार है. यह महत्वपूर्ण है इस बिंदु पर याद डिवाइस से हटाने के लिए सभी मीडिया कभी नहीं. हमेशा मुख्य चैनल में मीडिया छोड़ दें.

Protocol

भाग 1: microfluidic न्यूरॉन डिवाइस की तैयारी

एक 3 "SU-8 के बाहर photolithography द्वारा बनाई गई पैटर्न के साथ सिलिकॉन वफ़र polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic ढालना डाली प्रयोग किया जाता है हम SU-8 मास्टर, या molds के रूप नमूनों सिलिकॉन वफ़र को देखें." स्वामी.
PDMS / aw w 10:01 के अनुपात में इलाज के एजेंट के साथ मिलाया जाता है, कि PDMS के 10 ग्राम के लिए है,, यह इलाज के एजेंट के 1 ग्राम जोड़ा जाता है.
PDMS तो अच्छी तरह से मिश्रित है और सिलिकॉन वफ़र पर फेंक दिया. सिलिकॉन वफ़र एक 10 सेमी polystyrene पेट्री डिश के भीतर निहित है. यह लगभग 12 PDMS की 15 ग्राम के लिए लगभग 4 मिमी की मोटाई के साथ मास्टर को कवर लेता है.
मास्टर PDMS साथ तो पेट्री डिश बंद ढक्कन के साथ एक निर्वात dessicator में रखा गया है, और वैक्यूम लागू किया जाता है. यह PDMS, कि एजेंट इलाज में सरगर्मी दौरान शुरू किए गए थे से हवाई बुलबुले को दूर करने में मदद करने के लिए किया जाता है. यह हटाया जा करने के लिए हवाई बुलबुले के लिए लगभग 15 मिनट लगते हैं.
PDMS के साथ मास्टर dessicator से निकाल दिया जाता है. 0.45 उम फिल्टर के साथ एक हवा बंदूक के लिए किसी भी शेष बुलबुले को दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
गुरु तो एक एक घंटे के लिए इलाज के लिए 80 डिग्री सेल्सियस गर्म थाली पर रखा गया है.

नोट: यदि एक वैक्यूम dessicator उपलब्ध नहीं है, मास्टर को कई घंटे के लिए कमरे के तापमान पर छोड़ दिया जा सकता है. हवाई बुलबुले अंततः अपने दम पर फैलने जाएगा. यदि एक गर्म थाली उपलब्ध नहीं है, PDMS कमरे के तापमान पर 24 घंटे के बाद ठीक हो जाएगा.

नोट: यह भी महत्वपूर्ण है लगता है कि इलाज की प्रक्रिया के दौरान मास्टर स्तर है.

भाग 2: बाहर न्यूरॉन microfluidic युक्ति काटना

एक बार PDMS मास्टर पर ठीक है, यह एक साफ हुड के लिए लिया जाता है.
एक सर्जिकल ब्लेड का प्रयोग, एक चक्र उपकरणों की परिधि के आसपास काट रहा है. जब एक आवेषण PDMS में ब्लेड, यह महत्वपूर्ण है सिलिकॉन वफ़र के साथ संपर्क बनाने पर वफ़र पर डाल करने के लिए बहुत ज्यादा दबाव नहीं है, और मास्टर दरार जाएगा.
के साथ एक चक्र उपकरणों (वहाँ प्रत्येक 3 "सिलिकॉन मास्टर 4 प्रति उपकरणों रहे हैं) के आसपास सभी तरह काट, PDMS ध्यान से बंद मास्टर उठाया है यह धीरे सर्जिकल ब्लेड घुमा द्वारा शुरू किया जा सकता है के रूप में यह कटौती पूर्व में डाला जाता है. .
अगला, जलाशयों एक 8 मिमी ऊतक बायोप्सी पंच का उपयोग डिवाइस में छिद्रित हैं.
उपकरणों तो और quartered अतिरिक्त PDMS इतनी दूर छंटनी कि डिवाइस बड़े करीने से Corning कवर ग्लास (1 सं) 24 मिमी x 40 मिमी पर फिट होगा. नाइट्रोजन हवा दूर किसी भी अतिरिक्त मलबे को उड़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है. जिद्दी मलबे भी 3M स्कॉच ब्रांड 471 vinyl टेप का उपयोग कर हटाया जा सकता है.

भाग 3: प्लाज्मा गिलास को कवर फिसल जाता है के लिए उपकरणों के संबंध है.

प्लाज्मा क्लीनर बांड एक Harrick कवर फिसल जाता है न्यूरॉन उपकरणों के लिए प्रयोग किया जाता है. संक्षेप में, उपकरणों प्लाज्मा क्लीनर में रखा जाता है और एक वैक्यूम पंप के चैम्बर से हवा खाली करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
बाद वैक्यूम दबाव milliTorr 300 तक पहुँच गया है, बिजली पर बिजली का तार कर दिया है और उच्च करने के लिए सेट.
बिजली का तार प्लाज्मा बनाता है, "इलेक्ट्रॉनों, आयनों और तटस्थ परमाणुओं या अणुओं से मिलकर एक आंशिक रूप से ionized गैस" http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php शेष हवा अणुओं के बाहर के कक्ष में छोड़ दिया . प्लाज्मा कांच और डिवाइस है, जो जब एक साथ रखा एक स्थायी बांड फार्म का होगा की सतहों पर प्रतिक्रियाशील प्रजातियों बनाता है. प्लाज्मा भी हाइड्रोफिलिक सतहों, जो तरल पदार्थ के अलावा की सुविधा में मदद करता है बदल जाता है. इसके अतिरिक्त, प्लाज्मा क्लीनर उपकरणों sterilizes.

PDMS डिवाइस की सतह जिसमें microfluidic युक्ति चेहरा रखा गया है गिलास स्लाइड के साथ साथ प्लाज्मा क्लीनर में.

एक स्वच्छ बेंच पर कांच और microfluidic डिवाइस के प्लाज्मा इलाज सतहों को एक दूसरे के साथ संपर्क में इकट्ठा कर रहे हैं, तो बाँझ 60 मिमी बर्तन में रखा. इलाज सतहों एक तंग अपरिवर्तनीय बांड फार्म.
प्लाज्मा कांच के लिए उपकरणों के संबंध के 10 मिनट के भीतर, पाली एल Lysine (पीएलएल) डिवाइस के लिए जोड़ा जाता है. 10 मिनट के बाद, डिवाइस के hydrophilicity PLL डिवाइस में प्रवेश करने के लिए यह मुश्किल बनाने के लिए कम हो जाएगा.

नोट: यह PLL के अलावा के बाद डिवाइस में हवाई बुलबुले की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है . मुख्य चैनल में वायु बुलबुले अवांछनीय हैं, के रूप में वे कोशिकाओं oxidize होगा. एक आसान विधि के लिए किसी भी मौजूदा हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए एक P200 तरल के 150 उल (इस मामले PLL में) के साथ भरा pipet का उपयोग करने के लिए है, टिप सीधे मुख्य चैनल के उद्घाटन के अवसर पर जगह और P200 जबरदस्ती दबाना. यह कई बार दोहराया जा जरूरत है, लेकिन अंततः pipet से बल बुलबुले ड्राइव से बाहर होगी हो सकता है.
डिग्री सेल्सियस के साथ _5% सीओ 2 PLL युक्त उपकरणों के लिए 37 पर एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते अनुमति दी जाती है .
अगले दिन, डीफैलाया autoclaved dH2O के साथ दो बार जल्दी से rinsed हैं. इस प्रक्रिया के दौरान, तरल पूरी तरह से कभी नहीं मुख्य चैनल से हटा दिया जाता है जलाशयों से ही. मुख्य चैनल से तरल हटाना बुलबुले परिचय देंगे. 2 जल्दी rinses के बाद, उपकरणों autoclaved dH2O के साथ भर रहे हैं और वापस इनक्यूबेटर में 3 घंटे की एक न्यूनतम के लिए रखा, या रात.
अगले दिन, उपकरणों autoclaved dH2O के साथ एक बार फिर कर रहे हैं 2 बार जल्दी से rinsed. फिर, तंत्रिका बेसल मीडिया, आवश्यक B27 और संवर्धन प्राथमिक चूहा न्यूरॉन्स के लिए glutamax खुराक युक्त, उपकरणों के लिए जोड़ा है. उपकरणों को वापस इनक्यूबेटर में भविष्य में उपयोग के लिए रखा जाता है. उपकरणों को अब कर रहे हैं न्यूरॉन्स के बोने के लिए तैयार है.

Discussion

हम इस वीडियो में प्रदर्शन किया है कैसे बनाने के लिए एक PDMS microfluidic युक्ति है कि हम संस्कृति न्यूरॉन्स उपयोग करने के लिए तैयार अंदर युक्ति हमें एक शुद्ध axonal डिब्बे से microgrooves सेल शरीर, dendrites और axons की एक मिश्रण युक्त अलग अंश को प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है . इन उपकरणों के शोधकर्ता विभिन्न उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के रूप में अच्छी तरह के रूप में axons पर बाहर ले शारीरिक चोट और निरीक्षण इन उपचार न्यूरॉन्स पर क्या प्रभाव के लिए एक मंच प्रदान करने की अनुमति देते हैं. डिवाइस भी संवर्धन न्यूरॉन्स कि परिवहन अध्ययन की सुविधा में मदद करता है के लिए आदेश की एक स्तर प्रदान करता है. इसके अलावा, microgrooves, जो अक्षतंतु डिब्बे से सेल संस्कृति डिब्बे अलग दो डिब्बों यह डिवाइस के दूसरे पक्ष उपचार के साथ सीधे प्रभावशाली बिना संभव डिवाइस के एक तरफ का इलाज करने के लिए बनाने के बीच fluidic अलगाव के लिए अनुमति देता है. इस संपत्ति के शोधकर्ता संकेत transduction और उपचार से परिणाम है कि परिवहन के रूप में इस तरह के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner	Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media	Reagent	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass	cover glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
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References

Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).