Summary
Bu video kültür nöronlar için mikroakışkan bir cihaz farbricate için kullanabileceğiniz Polidimetil siloksan (PDMS) ile yumuşak litografi tekniği göstermektedir.
Abstract
Bu video, Polidimetil siloksan (PDMS) kültür nöronlar için mikroakışkan bir cihaz imal etmek için kullanılan yumuşak litografi tekniği göstermektedir. Daha önce, bir silikon yonga tasarımı ile SU-8 ve fotolitografi bir ana kalıp oluşturmak için, ya da biz sadece bir "master" olarak ne anlama kullanarak nöron mikroakışkan cihaz için desenli oldu. Sonra, silikon polimer PDMS sonra 1 saat için 80 ° C PDMS ısıtma ile tedavi ustanın üstüne dökün. PDMS cihazın olumsuz bir kalıp oluşturur. PDMS sonra dikkatlice kesilmiş ve ana uzak kaldırdı. Delik rezervuarları nerede olacak yumrukladı ve aşırı PDMS cihazdan kesilmiş. Azot cihazdan herhangi bir aşırı enkaz darbe için kullanılır. Bu noktada cihazlar artık kullanıma hazırdır ve plazma sterilizatör / temiz ya da geri dönüşümlü cam kapak cihaz sadece kapak cam üstüne koyarak bağlı olabilir ya Corning No: 1 cam kapak yapıştırılır. Geri dönüşümlü yapıştırma cam cihazın ayrı bir video kapalı ve cihaz% 70 etanol veya otoklav ile sterilize edilmelidir ilk gerektirir. Böylece başka tedaviye gerek yoktur Plazma tedavi cihazları sterilize eder. Bu yüzeyler hidrofilik iken, 10 dakika içinde plazma tedavi cihazlar sıvı eklemek için cihazlar, plazma tedavi ederken, ancak, önemlidir. Cihaz sıvı eklemek için 10 dakikadan daha uzun bir süre beklemek zor sıvı cihaz girmek için yapar. Nöron cihazlar genellikle cam ve 0.5 mg / ml pH 8.5 borat tamponu poli-L-lisin (PLL) kapsayacak şekilde plazma bağlı cihaz hemen eklenir. PLL ile inkübe en az 3 saat sonra, cihazlar her yıkama arasında en az 15 dakika dH2O su ile en az 3 kez yıkanır. Sonra, su çıkarılır ve taze medya cihazına eklenir. Bu noktada cihaz kullanıma hazır. Tüm medya cihazdan çıkarmak hiç bu noktada hatırlamak önemlidir. Her zaman ana kanal medya bırakın.
Protocol
Bölüm 1: mikroakışkan nöron cihaz hazırlanması
- 3 "SU-8 fotolitografi tarafından yapılmış bir model silikon gofret polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan kalıp döküm için kullanılır. Master kalıpları, ya da gibi SU-8 desenli silikon gofret bakın" efendileri ".
- PDMS 10:1 w / w oranında sertleştirici ile karıştırılır, PDMS 10 gram, 1 gram sertleştirici eklenir.
- PDMS sonra iyice karıştırılır ve silikon yonga üzerine dökülür. Silikon gofret 10 cm polistren Petri kabı içinde yer alıyor. Yaklaşık 4 mm kalınlığı ile ana kapsayacak şekilde PDMS, yaklaşık 12 g 15 g alır.
- PDMS ile ana ardından Petri kabı kapağı kapalı bir vakum desikatöre yerleştirilir ve vakum uygulanır. Bu sertleştirici karıştırma sırasında tanıtıldı PDMS hava kabarcıkları yardımcı olmak için yapılır. Bu hava kabarcıkları için yaklaşık 15 dakika sürer.
- PDMS ile ana desikatöre kaldırılır. 0.45 um filtresi ile bir hava tabancası kalan tüm kabarcıklarını çıkarmak için kullanılır.
- Usta daha sonra tedavisi için 1 saat için 80 ° C sıcak plaka üzerine yerleştirilir.
Not: bir vakum desikatöre mevcut değilse, ana birkaç saat oda sıcaklığında bırakılmalıdır. Bu hava kabarcıkları sonunda kendi kaybolacaktır. Sıcak bir levha mevcut değilse, PDMS oda sıcaklığında 24 saat sonra tedavi olacak.
Not: ana kür işlemi sırasında düzey olduğundan emin olmak da önemlidir.
Bölüm 2: Nöron mikroakışkan cihaz Kesme
- PDMS ana tedavi edildikten sonra, temiz bir kaput alınır.
- Cerrahi bıçak kullanarak, bir daire çevresinde cihazların kesilir. Bir PDMS içine bıçak ekler, silikon yonga ile temas kurmaya ama gofret çok fazla baskı önemlidir, başka ana çatlar.
- Cihazlar (her 3 "Silikon Yüksek Lisans başına 4 cihazları vardır) etrafında bir daire şekilde kesilmiş, PDMS ana dikkatlice kaldırdı. Önceden kesilmiş eklenir Bu cerrahi bıçak hafifçe bükerek başlamış olabilir .
- Sonra, rezervuarlar 8 mm doku biyopsisi yumruk kullanarak cihazın içine yumrukladı.
- Cihazlar, sonra dörde ve aşırı PDMS cihaz Corning Kapak Cam (No: 1) 24 mm x 40 mm uyacak böylece uzakta kesilmiş. Azot havanın herhangi bir aşırı enkaz darbe için kullanılır. İnatçı enkaz 3M Scotch Marka 471 vinil bant kullanarak silinebilir.
Bölüm 3: Plazma cam kapak fişleri cihazlar yapıştırma.
- Plazma Cleaner kapak fişleri harrick nöron cihazlar bağ kullanılır. Kısacası, plazma temizleyici cihazlar yerleştirilir ve bir vakum pompası odasından havayı tahliye etmek için kullanılır.
- Vakum basıncı 300 milliTorr ulaşıldıktan sonra, güç elektrik bobini açık ve yüksek ayarlanır.
- - Elektrik bobini "elektronlar, iyonlar ve nötr atomlar veya moleküller oluşan kısmen iyonize gaz, plazma oluşturur http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php odasında kalan hava moleküllerini sol. Plazma reaktif türler, cam ve kalıcı bir bağ oluşturur birlikte yerleştirildiği zaman, cihaz, yüzeyleri oluşturur. Plazma da, sıvıların yanı sıra kolaylaştırmak yardımcı hidrofilik yüzeyleri, döner. Ayrıca, plazma temizleyici cihazlar sterilize eder.
Mikroakışkan aygıtı içeren PDMS cihazın yüzey plazma temizleyici, cam slaytlar ile birlikte ön yüzü yukarıya yerleştirilir.
Cam ve mikroakışkan cihaz plazma tedavi yüzeyler daha sonra steril 60 mm yemekler yerleştirilir, temiz bir tezgah birbirleri ile temas halinde monte edilir. Tedavi yüzeyleri sıkı bir geri dönüşü olmayan bir bağ oluşturur. - 10 dakika içinde plazma cihazları cam yapıştırma, Poli-L-Lizin (PLL) cihaza eklenir. 10 dakika sonra, cihazın hydrophilicity PLL cihaz girmek için zor hale düşecektir.
Not: PLL eklenmesinden sonra cihaz hava kabarcıkları kontrol etmek için önemlidir. Hücreler okside olduğu gibi ana kanal içinde hava kabarcıkları, istenmeyen. Varolan herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için kolay bir yöntem, 150 ul (bu durumda PLL) sıvı ile dolu bir P200 pipetlemeyin kullanmak için, ana kanal açılışında ucu doğrudan yerleştirin ve zorla P200 bastırın. Bu birkaç kez tekrar edilmesi gerekebilir ama sonunda kuvvet pipetlemeyin kabarcıkları sürücü olacaktır. - PLL içeren cihazlar, 37 standart doku kültürü inkübatör geceleme inkübe izin ° C ile% 5 CO 2 .
- Ertesi gün de,kötü alışkanlıklardan otoklavlanmış dH2O iki kez hızlı bir şekilde durulanır. Bu işlem sırasında, sıvı tamamen sadece rezervuarları ana kanallar kaldırıldı asla. Ana kanal sıvı kaldırma kabarcıkları tanıtacak. 2 hızlı durular sonra, cihazlar otoklavlanmış dH2O ile doldurulur ve en az 3 saat bir inkübatör içine geri yerleştirilir ya da gecede vardır.
- Ertesi gün, cihazlar yine otoklavlanmış dH2O ile 2 kat hızlı durulanır. Ardından, gerekli takviyeleri B27 ve glutamax kültür birincil sıçan nöron içeren sinir bazal medya, cihazlar eklenir. Cihazlar, ileride kullanmak üzere inkübatör geri yerleştirilir. Şimdi, cihazlar nöronların tohumlama için hazırız.
Discussion
Bu video, cihaz bize hücre gövdeleri, dendrit ve akson bir karışımını içeren bölmesi microgrooves ayrı bir saf aksonal kesir elde etmek için içeri kültür nöronlar için kullanabileceğiniz bir PDMS mikroakışkan cihaz yapmak ve hazırlamak için nasıl göstermiştir . Bu cihazlar, araştırmacı, çeşitli tedavilerin etkilerini incelemek yanı sıra fiziksel yaralanma aksonlar yürütmek ve bu tedaviler nöronlar üzerindeki etkileri gözlemlemek için bir platform sağlamak için izin verir. Cihaz, aynı zamanda taşıma çalışmaları kolaylaştırmak yardımcı kültür nöronlar için bir düzeyi sağlar. Buna ek olarak, hücre kültürü bölmesi akson bölmesi ayrı microgrooves, mümkün cihazın diğer tarafında direkt tedavisi ile etkili olmadan bir cihazın yan tedavisinde iki bölmeleri arasında akışkan izolasyon sağlar. Bu özellik, araştırmacı, sinyal iletimi ve ulaşım tedavi sonucunda ortaya çıkan etkileri çalışma sağlar.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you | |
| Plasam Cleaner | Tool | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Neural Basal Media | Reagent | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
| Cornig No. 1 Cover Glass | cover glass | Corning | Corning No. X2935 244 | Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D |
| 60 mm Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-13A | 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass. |
| BD Falcon 50 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A |
| BD Falcon 15 ml tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| Poly-L-Lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| New Item |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
