Summary
현장 하이브리드화 분석에서 형광 펩타이드 핵산 (PNA 물고기)를 사용하여 긍정적인 혈액 배양에서 Enterococcus faecalis와 다른 Enterococcus 종의 직접 확인을위한 신속한 프로토콜.
Abstract
Enterococci는 E bacteremia의 일반적인 원인 아르 faecalis는 E. faecium 다음 지배 종족되고. 때문에 E.의 암피실린 및 vancomycin에 대한 저항 faecalis 여전히 드문 E. faecium에 저항 비교, enterococcal 수종 간의 차별을 허용하는 빠른 테스트의 개발은 적절한 치료와 저항 감시를 위해 중요합니다. E. faecalis OE PNA 물고기 분석 (AdvanDx, 워번, MA)는 현장 하이브리드화 형식으로 종의 특정 펩티드 핵산의 산성 (PNA) 형광에 프로브를 사용하여 1.5 시간과 종의 특정에 대한 중요한 정보를 제공하는 잠재적인 결과에 시간을 제공합니다 치료. Multicenter 연구는 1.5 시간 E.의 성능을 평가하기 위해 수행되었다 faecalis / OE PNA 물고기 절차는 원래 2.5 시간 분석 절차와 긍정적인 혈액 배양 병에서 직접 enterococci의 식별에 대한 표준 세균학 방법에 비해.
Protocol
1. 표본 수집 및 준비
- 패혈증 의심 환자의 정맥 혈액을 모아서 함께 한 혈액 문화 세트로 구성된이 BACTEC (BD, 스파크, MD) 혈액 배양 병 하나 에어로빅과 무산소 하나에 넣어.
- 35 BACTEC 9240 장비로 장소 병 ° C.
- 악기가 혈액 문화 병의 생물의 성장에 따라 경보로 실행 때까지 알을 품다.
- 혈액 문화기구에서 병을 제거합니다.
2. 이전 스테 이닝에 시약의 준비
- 직접 스테 이닝의 요리에 신선한 deionized 또는 증류수 240 ML 다음 60x 씻으 솔루션 4 ML을 추가하여 씻어 솔루션을 준비합니다.
- 따뜻하게하기 위해 55 ° C의 물을 욕조에 얼룩 요리 놔.
- 2-8에서 나머지 집중 ° C.를 저장
- 냉장고에서 장착 매체를 제거하고 실내 온도로 따뜻하게.
3. 그램 스테 이닝
- 부드럽게 소용돌이 혈액 문화 병.
- 바늘과 주사기 또는 subculturing 장치를 사용하여 멸균 나사 뒤덮힌 튜브 용기와 장소에서 혈액 (약 5 ML)를 제거하십시오.
- 멸균 피펫을 사용하여, 유리 현미경 슬라이드에 혈액 한 방울 큰 곳.
- 공기가 슬라이드를 건조하고 10 초 동안 메탄올로 수정.
- 공기 건조에 슬라이드 수 있습니다.
- 그램은 혈액 문화 병의 성장 유기체의 형태를 결정하는 혈액 필름에 얼룩 수행합니다.
- 기름 침지 렌즈를 사용하여 슬라이드를 볼 수 있습니다. 쌍 및 그램 얼룩에서 발견된 짧은 사슬에서 그람 양성 cocci는 enterococcus 종과 대부분 일치합니다.
- 이 그램 얼룩 결과는 다음 박테리아 식별에 사용할 적절한 PNA 물고기 프로브 키트의 선택을시킵니다. 이 혈액 문화 E.을 사용하여 물들일 것이다 faecalis / OE PNA 물고기는 얼룩.
4. PNA 피시 스테인
- 얼룩 준비하기 전에 소용돌이 치는하여 부드럽게 혈액이 들어있는 튜브를 섞는다.
- PNA 물고기의 현미경 슬라이드의 잘에 고정 솔루션 중 하나를 드롭 놓습니다.
- 고정 솔루션에 대한 긍정적인 혈액 문화와 튜브 10 μL 또는 작은 방울을 전송하고 유상으로 만들다에 부드럽게 섞는다.
- 20 분 그들을 가열하여 얼룩을 수정. 55 ° C 난방 접시에.
5. 품질 관리 자재
한 긍정적인 하나의 부정적인 품질 관리 슬라이드는 얼룩을위한 슬라이드의 각 배치에서 테스트해야합니다.
- E.을 사용 faecalis / OE 컨트롤이 목적을 위해 AdvanDx에서 구매하거나 E.의 참조 변종의 액체 문화에서 얼룩을 준비 슬라이드 faecalis와 별도의 슬라이드 또는 슬라이드 및 대조군의 재료로 황색 포도상 구균 연쇄상 구균 종 또는 종에 혼합하거나 긍정적인 제어로 E. faecium.
PNA 방법론이 세포 벽에 침투를 최적화하도록 설계되어 있기 때문에 QC 결과, 특히 적절한 시험 조건, 하이브 리다이 제이션 엄중 및 세포 벽 침투에 영향을 미치는 사람들을 위해 모니터 할 수있을 거예요
6. 이종 교잡
- E. 한 방울 추가 faecalis / 얼룩과 현미경 슬라이드에 잘하는 OE PNA.
- coverslip을 추가합니다. 기포를 사용하지 마십시오.
- 30 품어 ± 5 분. 55 ± 1 ° C 열판에
- 슬라이드 캐리어의 부화 장소에게 슬라이드 다음
7. 엄격한 와시
- 55 preheated 와시 용액에 담가 슬라이드 캐리어 ° C 조심스럽게 coverslip을 제거합니다. 종종 coverslip 부드럽게 씻으 솔루션에서 슬라이드를 agitating으로 해제 슬라이드. 때때로, coverslip은 부드럽게 포셉로 밀었해야합니다.
- 30 세척 솔루션 ± 5 분 안에 품어. 55 ± 1 ° C.
- 세척 용액에서 슬라이드를 제거
- 공기 건조에 슬라이드를 허용
8. 설치
- 각 슬라이드에 장착 매체 중 하나를 드롭 추가
- coverslip을 추가합니다. 기포를 사용하지 마십시오.
- 2 시간 이내에 형광 현미경에서 슬라이드를 확인합니다.
- 이 형광 담금질을 초래할 수 있으므로 태양 빛 또는 기타 강한 광원을 직접하기 위해 슬라이드를 노출시키지 마십시오.
9. 결과의 해석
슬라이드 시험에 사용되는 형광 현미경은 AdvanDx 듀얼 밴드 필터와 60x 100x 또는 석유 목표가 장착되어 있어야합니다. QC 슬라이드는 해당 하이브 리다이 제이션이 발생 한 확인 먼저 검사해야합니다. E.가 faecalis 볼의 여러 분야에서 밝은 녹색 형광 cocci과 같이 나타납니다와 E. faecium의 밝은 빨간색 cocci로 나타납니다. 비 enterococci 제어 슬라이드 nonfluorescent 나타납니다. 컨트롤 시스템을 확인한 후, 환자의 슬라이드는 검사를하실 수 있습니다. 혈액 fil 처음엔m은 붉은 나타납니다하지만 밝은 빨간색과 초록색 cocci 꽤 분명합니다.
녹색 긍정 E. 그림 1. 대표 예제 faecalis (왼쪽), 빨간색 긍정 E. faecium (중간), 그리고 부정 (오른쪽) 테스트 결과.
10. 대표 결과
세 기관이 PNA 물고기는 얼룩 평가 및 단지 검토되었습니다 단축 1.5 시간 프로토콜 2.5 시간 프로토콜을 비교 멀티 센터 임상 시험에 포함되었다. 쌍 및 체인의 152 일상 그램 긍정적인 cocci의 총 (GPC) 긍정적인 혈액 문화 병이 연구에 포함되었다. 100 % (152분의 152)가 수정된 결과 사이의 합의와 E.의 원래 분석 절차가 발생했습니다 faecalis / OE PNA 물고기 : 41분의 41 E. faecalis; 33분의 33 다른 enterococci와 78분의 78 기타 GPC (표 1). 이 얼룩 방법이 임상 시험 (표 2)에 아름다운 감성과 특이성을했다.
| 루틴 방법 | E. faecalis / OE PNA 물고기 표준 절차 | E. faecalis / OE PNA 물고기 짧은 절차 | |
| E. faecalis | 41 | 41 (그린 긍정적인) | 41 (그린 긍정적인) |
| E. faecium | 27 | 27 (긍정적인 빨강) | 27 (긍정적인 빨강) |
| E. casseliflavus | 2 | 2 (긍정적인 빨강) | 2 (긍정적인 빨강) |
| E. gallinarum | 2 | 2 (긍정적인 빨강) | 2 (긍정적인 빨강) |
| 기타 Enterococcus 종. | 2 | 2 (긍정적인 빨강) | 2 (긍정적인 빨강) |
| S. pneumoniae | 17 | 17 일 (제외) | 17 일 (제외) |
| S. viridans | 33 | 33 (부정적) | 33 (부정적) |
| S. 미티스 | 1 | 1 (제외) | 1 (제외) |
| S. pyogenes의 | 3 | 3 (제외) | 3 (제외) |
| S. 보비스 | 2 | 2 (음성) | 2 (음성) |
| S. salivarius | 1 | 1 (제외) | 1 (제외) |
| S. sanguinis | 2 | 2 (음성) | 2 (음성) |
| S. agalagtae | 7 | 7 (제외) | 7 (제외) |
| 다른 연쇄상 구균 종. | 7 | 7 (제외) | 7 (제외) |
| Abiotrophia 종. | 3 | 3 (제외) | 3 (제외) |
| Peptostrepococcus 종. | 2 | 2 (음성) | 2 (음성) |
| 합계 | 152 | 152분의 152 100 % 계약 | 152분의 152 100 % 계약 |
박테리아의 표 1. 목록은 표준 (2.5hr)와 빠른 (1.5 시간) 프로토콜 모두를 사용하여 테스트했습니다.
| 민감도 E.faecalis | 감도 기타 Enterococcus 종. | 특성 |
| 100 % (41분의 41) 95% CI (93.0-100) | 100 % (33분의 33) 33분의 33 95% CI (91.3-100) | 100 % (78분의 78) 95% CI (96.2-100) |
표 2. 1.5 시간 PNA 물고기 프로토콜의 민감도 및 특이성.
Discussion
E. enterococcus에 대한 faecalis / OE PNA 물고기 분석 2-3 일 이전에 표준의 문화 방식보다 신분증을 제공할 수 있습니다. 검정에 대한 단축 절차 (1.5 hourr)은 항균 치료 및 환자 결과에 대해서 좀더 나은 접근 방법에 대해 사용할 수있는 빠른 식별을 제공합니다. 이것을 지원하는 한 연구는 포레스트, 외. (6)에 의해 수행되었다. 2005 년에 시작 연속 2 년간 미생물학 연구실은 기존의 미생물 방법으로 혈액 배양 병에서 성장하고 2006 년 E.을 추가 쌍 및 체인의 그람 양성 cocci 확인 faecalis / OE PNA 물고기. 또한 기관 항균 팀 (AMT)가 개발한 치료 알고리즘은 효과적으로 적시에 실험실에 의해 생성된 PNA 물고기 데이터를 사용할 수 있습니다. 평가 주요 결과는 혈액 문화에서 시간 전에 효과적인 항균 요법의 실시로 그리기 및 PNA 물고기가 실험실의 흐름에 제정 이후되었습니다. 질병, 환자 위치와 경험주의 항균 요법의 심각도 측정했다. bacteremia enterococcal을 인수 병원과 224 환자의 총 미리 개입 기간 동안 129 및 PNA 물고기 기간의 95 평가했다. PNA 피시 E. 확인 이전 종래의 문화 (1.1 대 4.1 일, P <0.001)보다 faecalis 삼일. PNA 물고기는 평균 2.3 일 이전 E. faecium 확인 (1.1 대 3.4 일, P <0.001) 및 효과적인 치료 (1.3 대 3.1 일, P <0.001) 시작 시간에 통계적으로 의미있는 감소와 연관된이며 30 일 감소했다 사망률 (26 % 대 45%, P = 0.04). 이 그룹은 결론 그 E. AMT 처리 알고리즘과 함께 faecalis / OE PNA 물고기 분석은 E. faecium bacteremia을 인수 병원 환자에 적합한 경험주의 항균 요법의 개시 이전 결과.
- 라벨 및 시약에 인쇄된 유효 날짜가 어떠한 방식 으로든 수정해서는 안됩니다 이후 시약은 사용해서는 안됩니다. 그들은 사용하지 않을 때는 냉장고에 남아 있어야하거나 그들이 힘을 잃을 수 있습니다.
- 블러드 문화 병 전에 샘플링을 혼합해야합니다.
- 이 슬라이드 사이의 물질의 교차 오염을 일으킬하거나, 시약의 오염을 일으킬 수 있으므로 스포이트 병 팁이 핏자국을 만지는 것을 허용하지하는 것이 중요합니다.
- 물 목욕과 난방 블록 상수 55 ° C. 유지되어 있는지 확인
- 듀얼 밴드 필터 또는 색상 명확하게 분별하지 않습니다 이외의 필터를 사용하지 마십시오.
- 현미경 슬라이드 또는 하이브리드화 발생하지 않습니다 이외의 현미경 슬라이드를 사용하지 마십시오.
- 현미경 제대로 작동하는 것이 중요합니다. 현미경의 전구가 사용을위한 시간 승인 번호 내에 있는지 확인하십시오.
- 일부 드문 - 발생 Enterococcus 종은 PNA 프로브 이러한 E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E.의 saccharolyticus, E. solitarius 및 E와 같은 다른 Enterococcus 종에 hybridizing에 의해 감지되지 않습니다 . 유황.
- E.의 moraviensis는 E.으로 식별됩니다 시퀀스 유사성으로 인해 faecalis.
- 연쇄상 구균 anginosus의 일부 변종은 시퀀스 유사성으로 인해 거짓 긍정적인 녹색 형광을 생산합니다.
- VersaTREK 혈액 배양 병은 임상 연구 기간 동안 평가되지 않았습니다. E.을 감지하는 성능 faecalis 및 기타 Enterococcus는 종. VersaTREK 혈액 문화 병 알 수 있습니다.
- 표준 FITC 필터 듀얼 밴드 필터 대신 사용하는 경우 거짓 긍정적인 녹색 autofluorescence가 발생할 수 있습니다.
- 거짓 부정적인 결과가 자주 혼합 성장으로 인해 또는 분석 기술의 오류로 인해 발생할 수 있습니다.
- 사용하는 장비의 종류와 조건은 얻은 이미지의 시각적 모양에 영향을 미칠 것이다. 형광은 고용 현미경의 종류, 광원과 세포의 rRNA의 수준 varydue 수 있습니다
- 고체 미디어에 격리는 다른 생물과 혼합 성장을 차별하고 부정적인 결과를 항복 긍정적인 혈액 배양을 식별할 필요합니다.
- 이 제품은 혈액 배양 이외의 표본과 검증되지 않았습니다.
Disclosures
이 비디오 문서의 생산은 AdvanDx 후원했다. 벤자민 크리스탈이 문서에서 사용되는 도구와 시약을 만들어 AdvanDx의 직원입니다.
Acknowledgments
연구 AdvanDx 후원했다.
Materials
Reagents E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:
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References
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