Summary
一个从阳性的血液，使用一种肽核酸荧光原位杂交法（PNA FISH）文化，直接鉴定为粪肠球菌和其他肠球菌物种的快速协议。
Abstract
肠球菌是一种常见的原因与大肠杆菌菌血症粪被屎肠球菌的主要品种。由于耐氨苄青霉素和万古霉素在大肠杆菌中粪仍是少见相比，屎肠球菌的阻力，快速测试，使肠球菌物种之间的分化发展是很重要的，适当的治疗和耐药性监测。的大肠杆菌粪 OE PNA FISH检测（AdvanDx，沃本，马萨诸塞州）使用物种特异性的肽核酸（PNA）探针荧光原位杂交格式，并提供了一个时间为1.5小时和特定物种提供重要信息的可能性结果治疗。多中心研究，以评估E. 1.5小时的表现粪 / OE PNA鱼程序相比原来的2.5小时的检测程序和标准的细菌学方法对肠球菌的鉴定，直接从阳性血培养瓶。
Protocol
1。标本采集和准备
- 收集怀疑败血症患者的静脉血，放入两个BACTEC（BD，火花，MD）血培养瓶，一个有氧之一厌氧一起组成一个血培养集，。
- 广场瓶BACTEC 9240仪器35 ° C。
- 孵育直到仪器触发报警，由于微生物的生长，血培养瓶。
- 取出一瓶血培养仪。
2。试剂的制备染色前
- 准备加入4毫升新鲜去离子水或蒸馏水240毫升直接染色菜60X洗净解决方案的洗涤液。
- 放置在55℃水浴染色菜温暖。
- 存储其余集中在2-8 ° C。
- 从冰箱中取出安装介质和温暖的室温。
3。革兰氏染色
- 轻轻摇动血培养瓶。
- 使用针头和注射器或传代仪器，删除从瓶子在无菌螺丝上限管血（约5毫升）。
- 使用无菌吸管，将一个血一个玻璃显微镜玻片上的大幅下降。
- 空气干燥的幻灯片和甲醇固定为10秒。
- 允许幻灯片空气干燥。
- 进行革兰氏染色血膜，以确定血液中培养瓶中生长着的有机体的形态。
- 使用油浸镜头，查看幻灯片。在对和观察到的短链的革兰氏染色的革兰氏阳性球菌是最肠球菌种。
- 这种革兰氏染色的结果，那么驱动器选择适当的PNA FISH探针试剂盒，用于细菌鉴定。这血培养将被染色使用的大肠杆菌粪 / OE PNA鱼染色。
4。 PNA FISH染色
- 混合管中的血液轻轻纷飞前涂抹准备。
- 放置一个固定的解决方案上的PNA FISH显微镜幻灯片以及下降。
- 从管与血培养阳性10μL或一个小水滴转移到固定的解决方案，并轻轻混合乳化。
- 修复加热20分钟涂片。在55 ° C在加热板。
5。质量控制材料
一个正极和一个负极的质量控制幻灯片，必须进行测试，每批染色幻灯片。
- 使用E。粪 / OE控制幻灯片从AdvanDx购买用于此目的，或准备从液体培养 E.参考株细胞涂片粪肠球菌和大肠杆菌作为阳性对照，无论是在单独的幻灯片或上一张幻灯片和菌金黄色葡萄球菌或链球菌为阴性对照材料混合肠球菌。
QC成果应该能够监测相应的检测条件，特别是那些影响杂交紧缩和细胞壁渗透，因为巴勒斯坦民族权力机构的方法，旨在优化细胞壁渗透
6。杂交
- 添加E 的一滴粪 / OE巴勒斯坦民族权力机构与涂片的显微镜幻灯片以及。
- 加盖玻片。避免产生气泡。
- 孵育30 ± 5分钟。在55 ± 1 ° C的加热板
- 以下孵化的地方的幻灯片，在幻灯片的载体
7。严格的清洗
- 在预热的清洗液浸泡滑动载体，在55 ° C和小心取出盖玻片。通常情况下，盖玻片，轻轻搅拌清洗液中的幻灯片滑出。有时，必须轻轻推盖玻片，用镊子。
- 孵育在洗涤液30 ± 5分钟。在55 ± 1 ° C。
- 从洗涤液中取出的幻灯片
- 允许在空气干燥的幻灯片
8。安装
- 添加一个安装介质下降到每张幻灯片
- 加盖玻片。避免产生气泡。
- 在2小时内的荧光显微镜检查的幻灯片。
- 不要让幻灯片阳光直接照射或其他强光源，因为这可能导致荧光猝灭。
9。结果分析
必须配备AdvanDx双带通滤波器和一个60X或100X油客观，在荧光显微镜用于幻灯片检查。质量控制幻灯片，应首先检查确认，杂交确实发生。大肠杆菌粪应显示为明亮的绿色荧光球菌在多个领域的观点和屎肠球菌会出现明亮的红球菌。非肠球菌控制幻灯片应该出现nonfluorescent的。控制系统确认后，可以检查病人的幻灯片。起初，血液过滤米会出现偏红，但鲜艳的红色和绿色球菌会相当明显。
代表性的例子的绿色阳性E. 图1。 粪肠球菌 （左），红积极屎肠球菌（中）和负（右）的测试结果。
10。代表性的成果
三个机构，包括在一个多中心临床试验，评估这个PNA FISH染色和比较一个协议，以2.5小时缩短1.5小时的协议，刚刚被审查。共有152常规革兰氏阳性球菌对和链条（GPC）阳性血培养瓶被列入研究。协议修改后的结果是100％（152分之152）和E.原检测程序粪 / OE PNA鱼：41/41 E。粪肠球菌 ; 33/33肠球菌等78分之78其他的GPC（见表1）。此染色法在这项临床试验（表2）精美的敏感性和特异性。
| 常规方法 | 粪肠球菌 / OE PNA FISH标准程序 | 粪肠球菌 / OE PNA FISH简短过程 | |
| 粪肠球菌 | 41 | 41（绿正面） | 41（绿正面） |
| 屎肠球菌 | 27 | 27（红色正） | 27（红色正） |
| E. casseliflavus | 2 | 2（红色正） | 2（红色正） |
| E.鹑鸡 | 2 | 2（红色正） | 2（红色正） |
| 其他肠球菌。 | 2 | 2（红色正） | 2（红色正） |
| 肺炎链球菌 | 17 | 17（负） | 17（负） |
| 草绿色链球菌 | 33 | 33（负） | 33（负） |
| S. mitis | 1 | 1（负） | 1（负） |
| 化脓性链球菌 | 3 | 3（负） | 3（负） |
| 南牛 | 2 | 2（负） | 2（负） |
| 南唾液 | 1 | 1（负） | 1（负） |
| 南血统 | 2 | 2（负） | 2（负） |
| 南agalagtae | 7 | 7（负） | 7（负） |
| 其他链球菌。 | 7 | 7（负） | 7（负） |
| Abiotrophia SPP。 | 3 | 3（负） | 3（负） |
| Peptostrepococcus SPP。 | 2 | 2（负） | 2（负） |
| 共有 | 152 | 152分之152 100％协议 | 152分之152 100％协议 |
表1。上市细菌测试，使用标准（2.5hr）和快速（1.5小时）协议。
| 灵敏度E.faecalis | 灵敏度其他肠球菌。 | 特异性 |
| 100％（41/41） 95％CI（93.0-100） | 100％（33/33）33/33 95％CI（91.3-100） | 100％（七十八分之七十八） 95％CI（96.2-100） |
表2。1.5小时PNA FISH协议的灵敏度和特异性。
Discussion
的大肠杆菌肠球菌粪 / OE PNA FISH检测可以提供鉴定的标准培养方法相比，提前2-3天。缩短检测程序（1.5 hourr）提供了快速识别抗菌治疗和患者预后的一个更好的方法可以使用。福雷斯特， 等。（6）支持的一项研究。微生物实验室在2005年开始连续两年确定在双和链增长由传统的微生物学方法在血培养瓶，并于2006 年加入大肠杆菌革兰氏阳性球菌粪 / OE PNA鱼。此外治疗机构抗菌队（AMT）开发的算法，有效地使用PNA FISH及时实验室生成的数据。主要成果评估时间从血培养提请实施有效的抗菌治疗前，后进入实验室工作流程PNA FISH提起。严重性疾病，病人的位置和经验性抗菌治疗。共有224医院获得性肠球菌菌血症患者进行了评价与129前干预期间，在PNA FISH期间95。 PNA FISH鉴定大肠杆菌粪 3天前比传统文化（1.1 - 4.1天，p <0.001）。 PNA FISH确定屎肠球菌中位数为2.3天（1.1比3.4天，P <0.001），与时间统计学显着减少，发起有效的治疗方法（1.3 - 3.1天，p <0.001）和30天的下降死亡率（26％比45％，P = 0.04）。这个小组的结论是，在大肠杆菌在适当的经验性抗菌治疗早期开始收购的粪大肠杆菌菌血症患者与医院粪/ OE PNA FISH检测结果结合AMT处理算法。
- 不应该以任何方式修改后到期日期印在标签和试剂，试剂，不得使用。他们应该留在冰箱在不使用时，或他们可能会失去效力。
- 需要混合采样前血培养瓶。
- 重要的是不允许的滴管瓶端触摸血涂片，因为这可能会导致材料幻灯片之间的交叉污染，或造成污染的试剂。
- 确保保持在一个恒定的55℃水浴加热块
- 不要使用其他过滤器比双带通滤波器或颜色不会清楚看到。
- 不要使用比显微镜幻灯片或杂交不会发生其他的显微镜幻灯片。
- 重要的是显微镜的正常运作。确保显微镜灯泡使用时间内批准数。
- 一些罕见的发生肠球菌物种无法检测到的PNA探针杂交肠球菌的其他品种，如E. asinii，E.dispar，大肠杆菌haemoperoxidus，大肠杆菌cecorum，大肠杆菌columbae，大肠杆菌saccharolyticus，孤东和E， 。硫磺
- E. moraviensis被鉴定为E。由于序列相似的粪。
- 一些链球菌 anginosus菌株产生积极虚假的绿色荧光，由于序列相似性。
- VersaTREK血培养瓶在临床研究中未评估。性能检测大肠杆菌粪肠球菌和其他肠球菌菌属。与VersaTREK血培养瓶是未知之数。
- 如果是采用双带通滤波器，而不是一个标准的FITC标记的过滤器可能会出现假阳性的绿色自发荧光。
- 假阴性结果可能会经常发生由于混合生长，或由于检测技术中的错误。
- 所用仪器的类型和条件会影响所获得的图像的视觉外观。荧光可能varydue类型的显微镜，光源和rRNA基因在细胞水平
- 固体培养基上的分离是需要区分与其他生物的混合的生长，并产生了负面的结果，以确定血培养阳性。
- 比血培养标本，该产品还没有得到验证。
Disclosures
生产这种视频文章是由AdvanDx赞助。本杰明水晶AdvanDx，本文中使用的工具和试剂的雇员。
Acknowledgments
所AdvanDx赞助的研究。
Materials
Reagents E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:
|
References
- Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, , (2002).
- Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, , (2003).
- Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, , (2005).
- Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).
- Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, , (2006).
