Una procedura 1,5 ore per l'identificazione di Enterococcus Specie Direttamente da emocolture

Summary

Un protocollo rapido per l'identificazione diretta di Enterococcus faecalis ed Enterococcus altre specie da una emocoltura positiva con un Peptide Nucleic Acid test di ibridizzazione fluorescente in situ (FISH PNA).

Abstract

Gli enterococchi sono una causa comune di batteriemia con E. faecalis è la specie predominante seguito da E. faecium. Perché la resistenza alla ampicillina e vancomicina in E. faecalis è ancora raro in confronto alla resistenza in E. faecium, lo sviluppo di test rapidi consentono la differenziazione tra le specie enterococchi è importante per la terapia appropriata e sorveglianza della resistenza. La E. faecalis OE saggio PESCE PNA (AdvanDx, Woburn, MA) utilizza specie-specifico acido nucleico del peptide (PNA) delle sonde in una fluorescenza in formato ibridazione in situ ed offre un tempo per i risultati di 1,5 ore e il potenziale di fornire informazioni importanti per le specie-specifiche trattamento. Studi multicentrici sono stati condotti per valutare le prestazioni del 1,5 ore E. faecalis / OE procedimento FISH PNA rispetto alla originaria procedura di test 2,5 ore e di batteriologia metodi standard per l'identificazione degli enterococchi direttamente da una bottiglia positiva cultura del sangue.

Protocol

1. Raccolta e preparazione

1. Raccogliere il sangue venoso da pazienti con sospetto di sepsi e mettere in due BACTEC (BD, Sparks, MD) bottiglie di emocoltura, uno aerobici e anaerobici uno, insieme composto da un set di emocoltura.
2. Posizionare le bottiglie nel 9240 BACTEC strumento a 35 ° C.
3. Incubare fino a quando lo strumento viene attivato in allarme a causa della crescita di organismi in bottiglia emocoltura.
4. Rimuovere bottiglia dallo strumento emocoltura.

2. Preparazione dei reagenti prima della colorazione

1. Preparare la soluzione di lavaggio con l'aggiunta di 4 ml di soluzione di lavaggio 60x seguito da 240 ml di fresca acqua deionizzata o distillata direttamente al piatto colorazione.
2. Mettere il piatto nella colorazione ° 55 C a bagno d'acqua calda.
3. Conservare il concentrato rimanente a 2-8 ° C.
4. Rimuovere il liquido di montaggio dal frigorifero e riscaldare a temperatura ambiente.

3. Colorazione di Gram

1. Capovolgere delicatamente il flacone cultura del sangue.
2. Utilizzando un ago e la siringa o un apparato subcolture, rimuovere il sangue (circa 5 ml) dalla bottiglia e posto in una provetta sterile con tappo a vite.
3. Utilizzando una pipetta sterile, posizionare una goccia di sangue su un vetrino per microscopio.
4. Aria secca il vetrino e fissare in metanolo per 10 secondi.
5. Lasciare scorrere asciugare all'aria.
6. Eseguire una colorazione di Gram sul film del sangue per determinare la morfologia dell'organismo in crescita nella bottiglia emocoltura.
7. Utilizzando una lente immersione in olio, visualizzare diapositive. Cocchi Gram-positivi in ​​coppie e catene brevi osservati sul colorazione di Gram è più coerente con specie Enterococcus.
8. Questo risultato colorazione di Gram unità allora la scelta del proprio kit sonda PESCE PNA da utilizzare per l'identificazione batterica. Questa cultura del sangue saranno testate in base alla E. faecalis / OE PESCE PNA macchia.

4. PESCE PNA Stain

1. Mescolare la provetta contenente il sangue delicatamente agitando prima della preparazione striscio.
2. Porre una goccia di soluzione di fissaggio sul pozzo di un vetrino da microscopio PESCE PNA.
3. Trasferire 10 L o una piccola goccia dal tubo con la cultura del sangue positivo per la soluzione di fissaggio e mescolare delicatamente per emulsionare.
4. Fissare gli strisci di riscaldamento per 20 min. a 55 ° C su una piastra di riscaldamento.

5. Controllo Qualità del materiale

Uno positivo e uno negativo vetrino di controllo di qualità deve essere provato con ogni lotto di vetrini per la colorazione.

1. Usa E. faecalis / OE controllo Slides acquistato da AdvanDx a tale scopo o preparare strisci da colture liquide di ceppi di riferimento di E. faecalis e E. faecium come controllo positivo sia su diapositive separate o in comune in uno scivolo e Staphylococcus spp e Streptococcus spp come materiale di controllo negativo.

I risultati QC dovrebbe essere in grado di monitorare le condizioni per esami appropriati, in particolare quelle che riguardano rigore ibridazione e la penetrazione della parete cellulare, dal momento che la metodologia PNA è progettato per ottimizzare la penetrazione della parete cellulare

6. Ibridazione

1. Aggiungere una goccia di E. faecalis / OE PNA al pozzo sul vetrino con lo striscio.
2. Aggiungi coprioggetto. Evitare bolle d'aria.
3. Incubare per 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C sulla piastra di riscaldamento
4. A seguito di luogo di incubazione i vetrini in vettore scivolo

7. Lavaggio stringente

1. Vettore scorrere immergere nella soluzione di lavaggio preriscaldato a 55 ° C e rimuovere con attenzione il coprioggetto. Spesso, il coprioggetto scivola delicatamente agitando il vetrino nella soluzione di lavaggio. Occasionalmente, il coprioggetto deve essere delicatamente spinto fuori con le pinze.
2. Incubare la soluzione di lavaggio per 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C.
3. Rimuovere le diapositive dalla soluzione di lavaggio
4. Lasciare che il vetrino di aria secca

8. Montaggio

1. Aggiungere una goccia di liquido di montaggio ad ogni diapositiva
2. Aggiungi coprioggetto. Evitare bolle d'aria.
3. Esaminare il vetrino di un microscopio a fluorescenza entro 2 ore.
4. Non esporre le diapositive a luce solare diretta o altre fonti di luce forte come questo può portare alla estinzione di fluorescenza.

9. Interpretazione dei risultati

Il microscopio a fluorescenza utilizzato per l'esame diapositive devono essere equipaggiati con il filtro AdvanDx Dual Band e un obiettivo olio 60x o 100x. I vetrini QC devono essere esaminati prima di confermare che l'ibridazione si è verificato. E. faecalis dovrebbe apparire come luminosi verdi fluorescenti cocchi in molteplici campi di vista e la E. faecium apparirà come rosso brillante cocchi. Non enterococchi vetrino di controllo dovrebbe apparire nonfluorescent. Dopo aver confermato il sistema dei controlli, le diapositive paziente può essere esaminato. In un primo momento il sangue film appare rossastro, ma il rosso e il verde cocchi sarà molto evidente.

Esempi rappresentativi Figura 1. Verdi-positivi E. faecalis (a sinistra), rosso positivo E. faecium (al centro), e negative (a destra) i risultati dei test.

10. Rappresentante Risultati

Tre istituzioni sono stati inclusi in uno studio multicentrico studio clinico di valutazione del presente PESCE PNA macchia e confrontando un protocollo di 2,5 ore al ridotto 1,5 protocollo ora che è appena stato recensione. Un totale di 152 routine cocchi Gram-positivi in ​​coppie e catene (GPC) positivo bottiglie di emocoltura sono stati inclusi negli studi. Ci è stata del 100% (152/152) l'accordo tra i risultati delle modificati e la procedura di test originale per E. faecalis / OE PNA PESCE: 41/41 E. faecalis; 33/33 altri enterococchi e 78/78 GPC altri (Tabella 1). Questo metodo di colorazione era squisita sensibilità e specificità nel corso di questo studio clinico (Tabella 2).

	Metodi di routine	E. faecalis / OE PNA PESCE Procedura Standard	E. faecalis / OE PNA procedimento FISH breve
E. faecalis	41	41 (Verde Positivo)	41 (Verde Positivo)
E. faecium	27	27 (Red Positivo)	27 (Red Positivo)
E. casseliflavus	2	2 (rosso positivo)	2 (rosso positivo)
E. gallinarum	2	2 (rosso positivo)	2 (rosso positivo)
Altri Enterococcus spp.	2	2 (rosso positivo)	2 (rosso positivo)
S. pneumoniae	17	17 (negativo)	17 (negativo)
S. viridans	33	33 (negativo)	33 (negativo)
S. mitis	1	1 (negativo)	1 (negativo)
S. pyogenes	3	3 (negativo)	3 (negativo)
S. bovis	2	2 (negativo)	2 (negativo)
S. salivarius	1	1 (negativo)	1 (negativo)
S. sanguinis	2	2 (negativo)	2 (negativo)
S. agalagtae	7	7 (negativo)	7 (negativo)
Altri Streptococcus spp.	7	7 (negativo)	7 (negativo)
Abiotrophia spp.	3	3 (negativo)	3 (negativo)
Peptostrepococcus spp.	2	2 (negativo)	2 (negativo)
Totale	152	152/152 100% di accordo	152/152 100% di accordo

Elenco Tabella 1. Dei batteri testati utilizzando sia lo standard (2.5hr) e rapido (1,5 h) protocollo.

Sensibilità E.faecalis	Sensibilità Altri Enterococcus spp.	Specificità
100% (41/41) 95% CI (93,0-100)	100% (33/33) 33/33 95% CI (91,3-100)	100% (78/78) 95% CI (96,2-100)

Tabella 2. Sensibilità e Specificità del 1,5 ore protocollo FISH PNA.

Discussion

La E. faecalis / OE saggio FISH PNA per enterococco può fornire l'identificazione 2-3 giorni prima di metodi di coltura tradizionali. La procedura abbreviata per il test (1,5 hourr) fornisce una rapida identificazione che può essere utilizzato per un migliore approccio alla terapia antimicrobica e la prognosi del paziente. Uno studio a sostegno di questa è stata eseguita da Forrest, et al. (6). Oltre due anni consecutivi a partire dal 2005 il laboratorio di microbiologia identificato cocchi Gram-positivi in coppie e catene in crescita in bottiglie di emocoltura con metodi microbiologici tradizionali e nel 2006, aggiungendo la E. faecalis / OE PNA FISH. Inoltre, un algoritmo di trattamento sviluppato dal team istituzioni antimicrobici (AMT) di utilizzare efficacemente i dati PESCE ANP generati dal laboratorio in modo tempestivo. L'outcome primario valutato era giunto il momento di emocoltura attingere per l'attuazione di un'efficace terapia antibiotica prima e dopo PESCE PNA è stato istituito nel flusso di lavoro dei laboratori. Gravità della malattia, la posizione del paziente e la terapia antimicrobica empirica sono stati misurati. Un totale di 224 pazienti con batteriemia enterococciche acquisite in ospedale sono stati valutati con 129 nel periodo pre-intervento e 95 nel periodo PESCE PNA. PESCE PNA identificato E. faecalis 3 giorni prima di culture tradizionali (1,1 vs 4,1 giorni, p <0,001). PESCE PNA identificato E. faecium in media 2,3 giorni prima (1,1 vs 3,4 giorni, p <0,001) ed era associata a una riduzione statisticamente significativa nel tempo di iniziare la terapia efficace (1,3 vs 3,1 giorni, p <0,001) e una diminuzione 30 giorni mortalità (26% vs 45%, p = 0,04). Questo gruppo ha concluso che la E. faecalis / OE saggio PESCE PNA in combinazione con un algoritmo di trattamento AMT ha portato nelle precedenti l'inizio di una appropriata terapia antimicrobica empirica per i pazienti con acquisite in ospedale E. faecium batteriemia.

1. I reagenti non devono essere utilizzati dopo la data di scadenza stampata sulle etichette e reagenti non deve essere modificato in alcun modo. Dovrebbero rimanere in frigorifero quando non in uso o che potrebbero perdere potenza.
2. Bottiglie cultura del sangue devono essere miscelati prima del campionamento.
3. E 'importante non permettere che la punta del flacone contagocce di toccare uno striscio di sangue, perché questo potrebbe causare la contaminazione crociata di materiale tra le diapositive, o causare la contaminazione del reagente.
4. Assicurarsi che il bagno d'acqua e il blocco di riscaldamento sono mantenuti alla temperatura costante di 55 ° C.
5. Non utilizzare filtri diversi da quelli del filtro Dual Band o colori non sarà chiaramente discernere.
6. Non utilizzare vetrini da microscopio diversi preparati microscopici o ibridazione non si verificherà.
7. E 'importante che il microscopio sta funzionando correttamente. Assicurarsi che il bulbo microscopio è approvato entro il numero di ore di utilizzo.

• Alcune rare le specie Enterococcus non vengono rilevati dalla sonda di PNA ibridare le specie Enterococcus altri, come ad esempio E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, saccharolyticus E., E. solitarius ed E . sulfuree.
• Moraviensis E. è identificato come E. faecalis a causa di similarità di sequenza.
• Alcuni ceppi di Streptococcus anginosus produrre una fluorescenza verde falso positivo a causa di somiglianze sequenza.
• VersaTREK bottiglie cultura del sangue non sono state valutate nel corso degli studi clinici. Le prestazioni per rilevare E. Enterococcus faecalis ed altre spp. con bottiglie di emocoltura VersaTREK è sconosciuta.
• Falsi positivi autofluorescenza verde può verificarsi se uno standard FITC filtro viene utilizzato al posto del filtro Dual Band.
• Risultati falsi negativi possono verificarsi raramente a causa della crescita misti o causa di un errore nella tecnica di analisi.
• Il tipo e la condizione della strumentazione utilizzata influenzerà l'aspetto visivo dell'immagine ottenuta. La fluorescenza può varydue al tipo di microscopio impiegato, della fonte di luce e il livello di rRNA nelle cellule
• Isolamento su terreni solidi è necessario per differenziare la crescita mescolato con altri organismi e di identificare emocolture positive ottenendo un risultato negativo.
• Il prodotto non è stato convalidato con campioni diversi da emocolture.

Materials

Reagents E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components: Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent. E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide. 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol Quality control slides AdvanDX