Une procédure de 1,5 heure pour l'identification des Enterococcus Espèces directement à partir d'hémocultures

Summary

Un protocole rapide pour l'identification directe de Enterococcus faecalis et Enterococcus autre d'une hémoculture positive en utilisant un acide nucléique peptidique fluorescentes test d'hybridation in situ (FISH ANP).

Abstract

Les entérocoques sont une cause fréquente de bactériémie à E. faecalis étant l'espèce prédominante suivie par E. faecium. Parce que la résistance à l'ampicilline et à la vancomycine dans E. faecalis est encore rare comparée à la résistance de E. faecium, le développement de tests rapides permettant la différenciation entre les espèces entérocoques est important pour un traitement approprié et la surveillance de la résistance. Le E. faecalis OE test PNA FISH (AdvanDx, Woburn, MA) utilise des espèces spécifiques d'acides nucléiques peptides (PNA) des sondes dans une fluorescence en format hybridation in situ et offre un temps de résultat de 1,5 heures et le potentiel de fournir des informations importantes pour les espèces spécifiques traitement. Études multicentriques ont été effectuées pour évaluer la performance de l'1,5 heures E. faecalis / OE procédure de PNA FISH par rapport à la procédure de dosage 2,5 heures original et aux méthodes de la bactériologie standard pour l'identification des entérocoques directement d'un flacon d'hémoculture positive.

Protocol

1. Prélèvement et préparation

1. Recueillir le sang veineux de patients soupçonnés d'infection et mis dans deux BACTEC (BD, Sparks, MD) flacons d'hémoculture, une aérobie et anaérobie une, ensemble comprenant un ensemble d'hémoculture.
2. Placez les bouteilles dans le BACTEC 9240 l'instrument à 35 ° C.
3. Incuber tant que l'instrument est déclenchée une alarme en raison de la croissance des organismes dans le flacon d'hémoculture.
4. Enlever la bouteille de l'instrument de la culture du sang.

2. Préparation des réactifs avant la coloration

1. Préparer la solution de lavage en ajoutant 4 ml de solution de lavage 60x suivi par 240 ml d'eau déminéralisée ou distillée frais directement à l'antenne de coloration.
2. Mettez le plat dans la coloration de 55 ° C à bain d'eau tiède.
3. Stocker le concentré restant à 2-8 ° C.
4. Enlever le milieu de montage du réfrigérateur et à température ambiante.

3. La coloration de Gram

1. Remuer doucement le flacon d'hémoculture.
2. En utilisant une aiguille et la seringue ou d'un appareil de repiquage, enlever le sang (environ 5 ml) de la bouteille et placer dans un tube à vis stériles plafonné.
3. En utilisant une pipette stérile, déposer une goutte de sang sur un grand une lame de microscope en verre.
4. L'air sec de la lame et fixer au méthanol pendant 10 secondes.
5. Laisser sécher à l'air glisser.
6. Effectuer une coloration de Gram sur le film de sang pour déterminer la morphologie de l'organisme en croissance dans le flacon d'hémoculture.
7. En utilisant un objectif à immersion d'huile, affichage des diapositives. Cocci à Gram positif en paires et de courtes chaînes observées sur la coloration de Gram est la plus compatible avec les espèces Enterococcus.
8. Ce résultat Gram entraîne alors le choix de la trousse appropriée ANP sonde FISH à utiliser pour l'identification bactérienne. Cette culture de sang seront colorées à l'aide de la E. faecalis / OE PNA FISH tache.

4. PNA FISH Stain

1. Mélanger le tube contenant le sang doucement en remuant avant la préparation du frottis.
2. Déposer une goutte de solution de fixation sur le bien d'une diapositive ANP Microscope FISH.
3. Transfert 10 uL ou une petite goutte du tube avec l'hémoculture positive à la solution de fixation et mélanger délicatement pour émulsionner.
4. Fixer le frottis en les chauffant pendant 20 min. à 55 ° C sur une plaque chauffante.

5. Matériel de contrôle de qualité

Une positive et négative d'une diapositive de contrôle de qualité doivent être testés avec chaque lot de lames pour la coloration.

1. Utilisez E. faecalis / OE contrôle Diapositives acheté AdvanDx à cet effet ou préparer des frottis de cultures liquides des souches de référence de E. faecalis et E. faecium de contrôle positif, soit sur ​​des lames séparées ou mélangées sur une lame et Staphylococcus spp ou Streptococcus spp comme matériau de contrôle négatif.

Les résultats du CQ devraient être capables de surveiller les conditions d'essai appropriées, en particulier ceux qui affectent la rigueur d'hybridation et la pénétration de la paroi cellulaire, puisque la méthodologie PNA est conçu pour optimiser la pénétration des parois cellulaires

6. Hybridation

1. Ajouter une goutte de E. faecalis / OE PNA pour le bien sur la lame de microscope avec le frottis.
2. Ajouter lamelle. Eviter les bulles d'air.
3. Incuber pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C sur plaque chauffante
4. Après une incubation lieu les diapositives dans le support glisser

7. Lavez strictes

1. Porteuse glisser Plongez dans la solution de lavage préchauffé à 55 ° C et retirer délicatement la lamelle. Souvent, la lamelle glisse par les agitant doucement la lame dans la solution de lavage. Occasionnellement, la lamelle doit être doucement poussés hors avec une pince.
2. Incuber dans la solution de lavage pendant 30 ± 5 min. à 55 ± 1 ° C.
3. Retirez les diapositives de la solution de lavage
4. Laisser la lame sécher à l'air

8. Montage

1. Ajouter une goutte de milieu de montage à chaque diapositive
2. Ajouter lamelle. Eviter les bulles d'air.
3. Examiner la lame sur un microscope à fluorescence dans les 2 heures.
4. Ne pas exposer les diapositives à la lumière directe du soleil ou d'autres sources de lumière forte, car cela pourrait conduire à l'extinction de fluorescence.

9. Interprétation des résultats

Le microscope à fluorescence utilisé pour l'examen diapositive doit être équipé du filtre Dual Band AdvanDx et un objectif 60x ou 100x huile. Les diapositives doivent être examinées QC premier à confirmer que l'hybridation ne se produisent. E. faecalis doit apparaître comme un vert brillant fluorescent cocci dans de multiples domaines de vue et les E. faecium apparaîtra comme un rouge vif cocci. Lame de contrôle non-entérocoques devrait apparaître non fluorescent. Après avoir vérifié le système de contrôle, les diapositives des patients peuvent être examinés. Au début, le fil de sangm apparaîtra rouge mais le rouge vif et vert cocci sera tout à fait évident.

Des exemples représentatifs Figure 1. De vert-positif E. faecalis (à gauche), positif rouge E. faecium (au milieu), et les résultats des tests négatifs (à droite).

10. Les résultats représentatifs

Trois institutions ont été inclus dans un essai clinique multicentrique évaluant ce PNA FISH taches et comparant un protocole 2,5 heures à l'heure raccourcie 1.5 du protocole qui vient d'être examiné. Un total de 152 cocci à Gram positif en paires de routine et des chaînes (GPC) flacons d'hémoculture positifs ont été inclus dans les études. Il était de 100% (152/152) accord entre les résultats de l'modifiée et la procédure de dosage original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 et 78/78 autres entérocoques GPC d'autres (tableau 1). Cette méthode de coloration a une sensibilité exquise et une spécificité au cours de cet essai clinique (tableau 2).

	Méthodes de routine	E. faecalis / OE procédure standard ANP POISSONS	E. faecalis / OE procédure ANP POISSONS court
E. faecalis	41	41 (Vert Positif)	41 (Vert Positif)
E. faecium	27	27 (Rouge Positif)	27 (Rouge Positif)
E. casseliflavus	2	2 (Rouge Positif)	2 (Rouge Positif)
E. gallinarum	2	2 (Rouge Positif)	2 (Rouge Positif)
Autres Enterococcus spp.	2	2 (Rouge Positif)	2 (Rouge Positif)
S. pneumoniae	17	17 (négatif)	17 (négatif)
S. viridans	33	33 (négatif)	33 (négatif)
S. mitis	1	1 (négatif)	1 (négatif)
S. pyogenes	3	3 (négatif)	3 (négatif)
S. bovis	2	2 (négatif)	2 (négatif)
S. salivarius	1	1 (négatif)	1 (négatif)
S. sanguinis	2	2 (négatif)	2 (négatif)
S. agalagtae	7	7 (négatif)	7 (négatif)
Autres Streptococcus spp.	7	7 (négatif)	7 (négatif)
Abiotrophia spp.	3	3 (négatif)	3 (négatif)
Peptostrepococcus spp.	2	2 (négatif)	2 (négatif)
Total des	152	152/152 100% Accord	152/152 100% Accord

Listing Tableau 1. De bactéries testées en utilisant à la fois la norme (2.5hr) et rapide (1,5 h) protocole.

Sensibilité E.faecalis	Sensibilité autres Enterococcus spp.	La spécificité
100% (41/41) 95% (de 93,0 à 100) CI	100% (33/33) 33/33 95% (de 91,3 à 100) CI	100% (78/78) 95% (de 96,2 à 100) CI

Tableau 2. Sensibilité et spécificité du protocole de PNA FISH 1,5 heures.

Discussion

Le E. faecalis / OE test PNA FISH d'entérocoques peuvent fournir une identification 2-3 jours plus tôt que les méthodes standard de culture. La procédure abrégée pour le dosage (1,5 hourr) permet une identification rapide qui peut être utilisé pour une meilleure approche de la thérapie antimicrobienne et les résultats des patients. Une étude à l'appui de cette a été réalisée par Forrest et al. (6). Plus de deux années consécutives à partir de 2005, le laboratoire de microbiologie identifié cocci à Gram positif en paires et les chaînes de plus en plus par des flacons d'hémoculture méthodes microbiologiques traditionnelles et en 2006, ajoutant le E. faecalis / OE PNA FISH. En outre, un algorithme de traitement élaboré par l'équipe des institutions antimicrobiens (AMT) pour utiliser efficacement les données générées PNA FISH par le laboratoire dans les meilleurs délais. Principal résultat a été évaluée de temps à partir d'hémocultures attirer l'application de la thérapie antimicrobienne efficace avant et après PNA FISH a été institué dans le workflow des laboratoires. Gravité de la maladie, la localisation des patients et de traitement antimicrobien empirique ont été mesurés. Un total de 224 patients atteints de bactériémies nosocomiales à entérocoques ont été évalués à 129 dans la période d'intervention pré-et 95 dans la période de PNA FISH. PNA FISH identifié E. faecalis trois jours plus tôt que les cultures conventionnelles (1,1 vs 4,1 jours, p <0,001). PNA FISH identifié E. faecium une médiane de 2,3 jours plus tôt (1,1 vs 3,4 jours, p <0,001) et a été associée à une réduction statistiquement significative du temps d'entreprendre un traitement efficace (1,3 vs 3,1 jours, p <0,001) et une diminution de 30 jours de mortalité (26% vs 45%, p = 0,04). Ce groupe a conclu que les E. faecalis / OE test PNA FISH en conjonction avec un algorithme de traitement AMT a entraîné un démarrage plus précoce du traitement empirique antimicrobien approprié pour les patients atteints acquises à l'hôpital E. faecium bactériémie.

1. Réactifs ne doit pas être utilisé après la date d'expiration imprimée sur les étiquettes et les réactifs ne doivent pas être modifiés en aucune façon. Ils devraient rester dans le réfrigérateur lorsqu'il n'est pas utilisé ou ils pourraient perdre de puissance.
2. Flacons d'hémoculture doivent être mélangés avant l'échantillonnage.
3. Il est important de ne pas permettre à l'embout du flacon compte-gouttes toucher un frottis sanguin, car cela peut provoquer une contamination croisée du matériel entre les diapositives, ou provoquer une contamination du réactif.
4. Assurez-vous que l'eau du bain et le bloc de chauffage sont maintenus à une constante de 55 ° C.
5. Ne pas utiliser d'autres filtres que les filtres Dual Band ou les couleurs ne seront pas clairement discernées.
6. Ne pas utiliser des lames de microscope autres que les lames de microscope ou d'hybridation ne se produira pas.
7. Il est important que le microscope fonctionne correctement. Assurez-vous que l'ampoule microscope est dans le nombre d'heures approuvées pour l'utilisation.

• Certaines espèces rares survenant Enterococcus ne sont pas détectés par la sonde PNA s'hybrider avec les espèces Enterococcus autres, comme E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, saccharolyticus, E. solitarius et E . sulfureuse.
• Moraviensis E. est identifié comme E. faecalis en raison de similarités de séquence.
• Certaines souches de Streptococcus anginosus produire une fausse fluorescence verte positif en raison de similarités de séquence.
• Bouteilles VersaTREK hémoculture n'ont pas été évaluées au cours des études cliniques. La performance pour détecter E. faecalis et d'autres Enterococcus spp. avec des bouteilles VersaTREK hémoculture est inconnue.
• Faux positifs autofluorescence verte peut se produire si une norme filtre FITC est utilisé au lieu du filtre Dual Band.
• Résultats faux négatifs peuvent se produire fréquemment en raison de la croissance mixte ou due à une erreur dans la technique de dosage.
• Le type et l'état de l'instrumentation utilisée va influencer l'aspect visuel de l'image obtenue. La fluorescence peut varydue le type de microscope utilisé, la source lumineuse et le niveau de l'ARNr dans les cellules
• Isolement sur milieu solide est nécessaire de différencier la croissance mélangé avec d'autres organismes et d'identifier les hémocultures positives qui donne un résultat négatif.
• Le produit n'a pas été validée avec des échantillons autres que les cultures de sang.

Materials

Reagents E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components: Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent. E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide. 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol Quality control slides AdvanDX