Een 1,5 uur Procedure voor de identificatie van Enterococcus Soorten Rechtstreeks van bloedkweken

Summary

Een snelle protocol voor de directe identificatie van Enterococcus faecalis en Enterococcus andere soorten uit een positieve bloedkweek met behulp van een Peptide Nucleic Acid fluorescente in situ hybridisatie assay (PNA FISH).

Abstract

Enterokokken zijn een veel voorkomende oorzaak van bacteriëmie met E. faecalis zijnde de belangrijkste soorten, gevolgd door E. faecium. Omdat de resistentie tegen ampicilline en vancomycine in E. faecalis is ongewoon nog steeds vergeleken met weerstand in E. faecium, de ontwikkeling van snelle tests waardoor differentiatie tussen enterokokkeninfecties soorten is belangrijk voor de juiste therapie en resistentie surveillance. De E. faecalis OE PNA FISH-test (AdvanDx, Woburn, MA) maakt gebruik van soortspecifieke peptide nucleïnezuur (PNA) sondes in een fluorescentie in situ hybridisatie formaat en biedt een tijd om de resultaten van 1,5 uur en de mogelijkheden van het verstrekken van belangrijke informatie voor de soortspecifieke behandeling. Multicenter studies werden uitgevoerd om de prestaties van de 1,5 uur E. beoordelen faecalis / OE PNA FISH procedure ten opzichte van de oorspronkelijke 2,5 uur test procedure en standaard bacteriologie methoden voor de identificatie van enterokokken rechtstreeks vanuit een positieve bloedkweek fles.

Protocol

1. Specimen Collection en de voorbereiding

1. Verzamel veneuze bloed van patiënten verdacht van sepsis en in twee BACTEC (BD, Sparks, MD) bloedkweek flessen, een aërobe en anaërobe een, samen bestaande uit een bloed-cultuur in te stellen.
2. Plaats flessen in de BACTEC 9240 instrument bij 35 ° C.
3. Incubeer tot het instrument is geactiveerd in alarm als gevolg van de groei van organismen in het bloed cultuur fles.
4. Verwijder fles uit de bloedkweek instrument.

2. Voorbereiding van de reagentia vóór de kleuring

1. Bereid de wasoplossing door het toevoegen van 4 ml van 60x Wash Solution, gevolgd door 240 ml vers gedeïoniseerd of gedestilleerd water rechtstreeks naar de Staining Dish.
2. Zet de schotel in de kleuren van 55 ° C waterbad om op te warmen.
3. Bewaar de resterende concentreren bij 2-8 ° C.
4. Haal de Mounting Medium uit de koelkast en warm tot kamertemperatuur.

3. Gram Kleuring

1. Zwenk de bloedkweek fles.
2. Met behulp van een naald en spuit of een subcultuur apparaat, verwijder het bloed (ongeveer 5 ml) uit de fles en plaats in een steriele schroef buisje.
3. Met behulp van een steriele pipet, plaats een grote druppel bloed op een glas microscoopglaasje.
4. Drogen aan de lucht van de dia en vast te stellen in methanol gedurende 10 seconden.
5. Laat schuif aan de lucht drogen.
6. Voer een Gram vlek op het bloed film aan de morfologie van het organisme groeien in het bloed cultuur fles vast te stellen.
7. Met behulp van een olie-immersie lens, bekijken glijbaan. Gram-positieve kokken in paren en korte ketens waargenomen op de Gramkleuring is het meest overeen met Enterococcus species.
8. Dit Gramkleuring resultaat rijdt dan is de keuze van de juiste PNA FISH probe kit om te gebruiken voor bacteriële identificatie. Dit bloed cultuur worden gekleurd met behulp van de E. faecalis / OE PNA FISH vlek.

4. PNA FISH Stain

1. Meng de buis met het bloed langzaam door de wervelende voorafgaand aan uitstrijkje voorbereiding.
2. Plaats een druppel van Fixation Solution op het goed van een PNA FISH microscoopglaasje.
3. Breng 10 ui of een kleine druppel uit de buis met de positieve bloedkweek op de Fixation Solution en meng voorzichtig te emulgeren.
4. Bevestig de uitstrijkjes door ze te verwarmen gedurende 20 minuten. bij 55 ° C op een verwarmingsplaat.

5. Quality Control Materiaal

Een positieve en een negatieve kwaliteitscontrole glijbaan moet worden getest met iedere batch van dia's voor kleuring.

1. Gebruik E. faecalis / OE Controle Slides gekocht AdvanDx voor dit doel of vlekken van vloeistoffen culturen van referentie stammen van E. voor te bereiden faecalis en E. faecium als positieve controle, hetzij op afzonderlijke dia's of gemengd op een dia en Staphylococcus spp of Streptococcus spp als negatieve controle materiaal.

De QC-resultaten moeten in staat zijn om toezicht te houden op het testen van omstandigheden, met name die die hybridisatie strengheid en celwand penetratie, omdat PNA methodiek is ontwikkeld om de celwand penetratie te optimaliseren

6. Hybridisatie

1. Voeg een druppel van E. faecalis / OE PNA naar de put op de microscoop dia met het uitstrijkje.
2. Toe te voegen dekglaasje aan. Luchtbellen te voorkomen.
3. Incubeer gedurende 30 ± 5 minuten. bij 55 ± 1 ° C bij verhitting plaat
4. Na incubatie plaats de dia's in slide carrier

7. Strenge Wash

1. Dompel schuif vervoerder in de voorverwarmde Wash Solution bij 55 ° C en verwijder voorzichtig de dekglaasje aan. Vaak is de dekglaasje glijdt door voorzichtig schudden van de dia in de Wash Solution. Af en toe moet het dekglaasje voorzichtig worden geduwd met een pincet.
2. Incubeer in het wasoplossing gedurende 30 ± 5 minuten. bij 55 ± 1 ° C.
3. Verwijder de dia's van de wasoplossing
4. Laat de schuif aan de lucht drogen

8. Montage

1. Voeg een druppel Mounting Medium aan elke dia
2. Toe te voegen dekglaasje aan. Luchtbellen te voorkomen.
3. Onderzoek de dia op een fluorescentie microscoop binnen 2 uur.
4. Niet blootstellen de dia's aan zonlicht of andere sterke lichtbronnen direct, omdat dit kan leiden tot fluorescentie quenching.

9. Interpretatie van de resultaten

De fluorescentie microscoop gebruikt voor slide onderzoek moet worden uitgerust met de AdvanDx Dual Band Filter en een 60x of 100x olie doelstelling. De QC-slides moet eerst worden onderzocht om te bevestigen dat hybridisatie deed voorkomen. E. faecalis moeten verschijnen zo helder groen fluorescent kokken in meerdere velden van uitzicht en de E. faecium zal verschijnen als heldere rode kokken. Niet-enterokokken controle dia moet verschijnen nonfluorescent. Na het bevestigen van het systeem bij de controles, kan de patiënt dia's worden onderzocht. In het begin van het bloed film zal verschijnen roodachtige, maar de heldere rode en groene kokken zal heel duidelijk.

Figuur 1. Representatieve voorbeelden van groene-positieve E. faecalis (links), rode positieve E. faecium (midden), en negatieve (rechts) testresultaten.

10. Representatieve resultaten

Drie instellingen werden opgenomen in een multi-center klinische studie ter evaluatie van deze PNA FISH vlek en het vergelijken van een 2,5 uur protocol bij de verkorte 1,5 uur protocol dat net is beoordeeld. Een totaal van 152 routine Gram-positieve kokken in paren en ketens (GPC) positieve bloedkweek flessen werden opgenomen in de studies. Er was 100% (152/152) overeenkomst tussen de resultaten van de gewijzigde en de oorspronkelijke test procedure voor E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis; 33/33 andere enterokokken en 78/78 andere GPC (tabel 1). Deze vlekken methode had verfijnde sensitiviteit en specificiteit tijdens deze klinische studie (tabel 2).

	Routine Methoden	E. faecalis / OE PNA FISH Standaard Procedure	E. faecalis / OE PNA FISH korte procedure
E. faecalis	41	41 (Groen Positief)	41 (Groen Positief)
E. faecium	27	27 (Red Positief)	27 (Red Positief)
E. casseliflavus	2	2 (Red Positief)	2 (Red Positief)
E. gallinarum	2	2 (Red Positief)	2 (Red Positief)
Andere Enterococcus spp.	2	2 (Red Positief)	2 (Red Positief)
S. pneumoniae	17	17 (negatieve)	17 (negatieve)
S. viridans	33	33 (negatieve)	33 (negatieve)
S. mitis	1	Een (negatieve)	Een (negatieve)
S. pyogenes	3	3 (negatieve)	3 (negatieve)
S. bovis	2	2 (negatieve)	2 (negatieve)
S. salivarius	1	Een (negatieve)	Een (negatieve)
S. sanguinis	2	2 (negatieve)	2 (negatieve)
S. agalagtae	7	7 (negatieve)	7 (negatieve)
Andere Streptococcus spp.	7	7 (negatieve)	7 (negatieve)
Abiotrophia spp.	3	3 (negatieve)	3 (negatieve)
Peptostrepococcus spp.	2	2 (negatieve)	2 (negatieve)
Totaal	152	152/152 100% akkoord	152/152 100% akkoord

Tabel 1. Vermelding van bacteriën getest met zowel de standaard (2.5hr) en snel (1,5 uur) protocol.

Gevoeligheid E.faecalis	Gevoeligheid Andere Enterococcus spp.	Specificiteit
100% (41/41) 95% CI (93,0 tot 100)	100% (33/33) 33/33 95% CI (91.3-100)	100% (78/78) 95% CI (96.2-100)

Tabel 2. Sensitiviteit en specificiteit van de 1,5 uur PNA FISH protocol.

Discussion

De E. faecalis / OE PNA FISH-test voor Enterococcus kunnen identificeren 2-3 dagen eerder dan standaard kweekmethoden. De verkorte procedure voor de test (1,5 hourr) zorgt voor een snelle identificatie die kan worden gebruikt voor een betere aanpak voor antimicrobiële therapie en prognose van de patiënt. Een studie om dit te ondersteunen werd uitgevoerd door Forrest, et al.. (6). Meer dan twee opeenvolgende jaren vanaf 2005 het microbiologisch laboratorium geïdentificeerd Gram-positieve kokken in paren en ketens steeds meer in het bloed cultuur flessen door middel van conventionele microbiologische methoden en in 2006 het toevoegen van de E. faecalis / OE PNA FISH. Naast een behandeling algoritme ontwikkeld door de instellingen antimicrobiële team (AMT) effectief met de PNA FISH gegevens die zijn gegenereerd door het laboratorium in de tijdige wijze. Beoordeeld primaire uitkomstmaat was de tijd van bloed cultuur tot de invoering van doeltreffende antimicrobiële therapie te trekken voor en na de PNA FISH werd ingesteld in de laboratoria workflow. Ernst van de ziekte, de patiënt locatie en empirische antimicrobiële therapie werden gemeten. Een totaal van 224 patiënten met het ziekenhuis verworven enterokokkeninfecties bacteriëmie werden beoordeeld met 129 in de pre-interventie periode en 95 in de PNA FISH periode. PNA FISH geïdentificeerd E. faecalis 3 dagen eerder dan de conventionele culturen (1,1 versus 4,1 dagen, p <0,001). PNA FISH geïdentificeerd E. faecium een ​​mediaan 2,3 dagen eerder (1,1 versus 3,4 dagen, p <0,001) en werd geassocieerd met een statistisch significante vermindering in de tijd aan de start van effectieve therapie (1,3 versus 3,1 dagen, p <0,001) en verminderde 30 dagen sterfte (26% vs 45%, p = 0,04). Deze groep concludeerde dat de E. faecalis / OE PNA FISH-test in combinatie met een AMT behandeling algoritme resulteerde in eerdere initiatie van de nodige empirische antimicrobiële therapie voor patiënten met het ziekenhuis verworven E. faecium bacteriëmie.

1. Reagentia moeten niet worden gebruikt na de vervaldata vermeld op de etiketten en reagentia moeten niet worden gewijzigd in any way. Zij moeten blijven in de koelkast wanneer niet in gebruik of ze zou kunnen verliezen potentie.
2. Bloedkweek flessen moeten vóór de bemonstering worden gemengd.
3. Het is belangrijk om niet toe dat de druppelflesje tip om een ​​bloeduitstrijkje raken omdat dit kan kruisbesmetting van materiaal tussen dia's veroorzaken, of leiden tot besmetting van het reagens.
4. Zorg ervoor dat het waterbad en de verwarming blok worden gehandhaafd op een constante 55 ° C.
5. Geen gebruik maken van filters met uitzondering van de Dual Band filter of kleuren worden niet duidelijk onderscheiden.
6. Gebruik geen microscoopglaasjes anders dan de Microscope Slides of hybridisatie zal niet optreden.
7. Het is belangrijk dat de microscoop naar behoren functioneert. Zorg ervoor dat de microscoop lamp is binnen de goedgekeurde aantal uren voor gebruik.

• Enkele zeldzame voorkomende Enterococcus species zijn niet gedetecteerd door de PNA probe hybridiseren aan andere Enterococcus soorten, zoals E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitarius en E . zwavel.
• E. moraviensis wordt geïdentificeerd als E. faecalis als gevolg van volgorde overeenkomsten.
• Sommige stammen van Streptococcus anginosus produceren een vals positieve groene fluorescentie als gevolg van volgorde overeenkomsten.
• VersaTREK bloedkweek flessen werden niet geëvalueerd tijdens de klinische studies. De prestaties van E. te detecteren faecalis en andere Enterococcus spp. met VersaTREK bloedkweek flesjes is onbekend.
• Vals-positieve groene autofluorescentie kan zich voordoen als een standaard FITC-filter wordt gebruikt in plaats van de Dual Band Filter.
• Vals-negatieve resultaten kunnen zelden optreden als gevolg van groei of gemengde wegens een fout in assay techniek.
• Het type en de conditie van de gebruikte instrumentarium zal invloed hebben op de visuele weergave van de verkregen beeld. De fluorescentie kan varydue van het type microscoop gebruikt, de lichtbron en het niveau van rRNA in de cellen
• Isolatie op vaste media is nodig om gemengd groei differentiëren met andere organismen en positieve bloedkweken waardoor een negatief resultaat te identificeren.
• Het product is niet gevalideerd met monsters andere dan bloed culturen.

Materials

Reagents E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components: Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent. E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide. 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol Quality control slides AdvanDX