Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

की पहचान के लिए एक 1.5 घंटो प्रक्रिया Enterococcus प्रजाति सीधे रक्त संस्कृतियों से

doi: 10.3791/2616 Published: February 10, 2011

Summary

स्वस्थानी संकरण परख में फ्लोरोसेंट एक पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (PNA मछली) का उपयोग कर एक सकारात्मक रक्त संस्कृति से Enterococcus faecalis और अन्य Enterococcus प्रजातियों के प्रत्यक्ष पहचान के लिए एक तेजी से प्रोटोकॉल.

Abstract

Enterococci ई. साथ bacteremia का एक आम कारण हैं faecalis प्रमुख ई. faecium द्वारा पीछा प्रजातियों जा रहा है. क्योंकि एम्पीसिलीन और ई. में vancomycin प्रतिरोध faecalis अभी भी असामान्य है ई. faecium में प्रतिरोध की तुलना में, तेजी से enterococcal प्रजातियों के बीच भेदभाव की अनुमति परीक्षण के विकास उपयुक्त चिकित्सा और प्रतिरोध निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. ई. faecalis ँ PNA मछली परख (AdvanDx, Woburn, एमए) स्वस्थानी संकरण प्रारूप में प्रजातियों विशिष्ट पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (PNA) एक प्रतिदीप्ति में जांच का उपयोग करता है और 1.5 घंटे और प्रजाति विशेष के लिए महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करने की क्षमता के परिणाम के लिए एक समय प्रदान करता है है उपचार. Multicenter अध्ययन के लिए 1.5 घंटे ई. के प्रदर्शन का आकलन करने के लिए प्रदर्शन किया गया / faecalis ँ PNA मछली प्रक्रिया मूल 2.5 घंटे परख प्रक्रिया और enterococci का एक सकारात्मक रक्त संस्कृति बोतल से सीधे पहचान के लिए मानक जीवाणु तरीकों की तुलना में.

Protocol

1. नमूना संग्रह और तैयार

  1. पूति के संदिग्ध रोगियों से शिरापरक रक्त ले लीजिए और दो BACTEC (बी, स्पार्क्स, एमडी) संस्कृति रक्त की बोतलें, एक एरोबिक और anaerobic एक, एक साथ एक रक्त संस्कृति सेट शामिल में डाल दिया.
  2. पर 35 प्लेस BACTEC साधन 9240 में की बोतलें डिग्री सेल्सियस
  3. सेते हैं जब तक साधन जीवों के रक्त संस्कृति के बोतल में विकास के कारण अलार्म में शुरू हो रहा है.
  4. रक्त संस्कृति साधन से बोतल निकालें.

2. अभिकर्मकों के धुंधला हो जाना करने के लिए पहले तैयार

  1. 60x धो 240 ताजा विआयनीकृत या आसुत जल का धुंधला डिश सीधे एमएल द्वारा पीछा समाधान के 4 एमएल जोड़कर धोने समाधान तैयार.
  2. 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में धुंधला डिश रखो गर्म करने के लिए.
  3. 2-8 पर ध्यान केंद्रित शेष डिग्री सेल्सियस स्टोर
  4. रेफ्रिजरेटर से बढ़ते मध्यम निकालें और कमरे के तापमान पर गर्म.

3. ग्राम धुंधला

  1. धीरे रक्त संस्कृति बोतल ज़ुल्फ़.
  2. एक सुई और सिरिंज या एक subculturing तंत्र का प्रयोग, बोतल और एक बाँझ पेंच छाया ट्यूब में जगह से खून (लगभग 5 एमएल) को हटा दें.
  3. एक बाँझ पिपेट का उपयोग, एक गिलास खुर्दबीन स्लाइड पर खून की एक बड़ी ड्रॉप जगह है.
  4. एयर स्लाइड शुष्क और मेथनॉल में 10 सेकंड के लिए ठीक है.
  5. शुष्क हवा करने के लिए स्लाइड की अनुमति दें.
  6. प्रदर्शन एक ग्राम रक्त फिल्म पर दाग रक्त संस्कृति बोतल में बढ़ रहा है जीव की आकारिकी निर्धारित करने के लिए.
  7. एक तेल विसर्जन लेंस का प्रयोग, स्लाइड देखने के लिए. जोड़े और छोटी ग्राम दाग पर मनाया चेन में ग्राम सकारात्मक cocci सबसे enterococcus प्रजातियों के साथ संगत है.
  8. यह ग्राम दाग परिणाम तो उचित PNA मछली जांच किट का चयन जीवाणु पहचान के लिए उपयोग करने के लिए ड्राइव. यह रक्त संस्कृति ई. का उपयोग दाग जाएगा / faecalis ँ PNA मछली दाग.

4. PNA मछली दाग

  1. मिक्स रक्त धब्बा तैयारी से पहले घूमता धीरे युक्त ट्यूब.
  2. एक PNA मछली माइक्रोस्कोप स्लाइड की अच्छी तरह पर एक फिक्सेशन समाधान के ड्रॉप प्लेस.
  3. फिक्सेशन समाधान के लिए सकारात्मक रक्त संस्कृति के साथ ट्यूब से 10 μL या एक छोटे से ड्रॉप और हस्तांतरण धीरे मिश्रण करने के लिए रासायनिक पायसी.
  4. उन्हें 20 मिनट के लिए हीटिंग से स्मीयरों ठीक. 55 डिग्री सेल्सियस एक गर्म थाली पर.

5. गुणवत्ता नियंत्रण सामग्री

एक सकारात्मक और एक नकारात्मक गुणवत्ता नियंत्रण स्लाइड धुंधला के लिए स्लाइड्स के प्रत्येक बैच के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए.

  1. ई. का उपयोग करें faecalis / ँ नियंत्रण AdvanDx से इस उद्देश्य के लिए खरीदा या ई. के संदर्भ उपभेदों के तरल संस्कृतियों से स्मीयरों तैयार स्लाइड्स faecalis और या तो अलग स्लाइड्स पर या एक स्लाइड और Staphylococcus एसपीपी या स्ट्रैपटोकोकस एसपीपी के रूप में नकारात्मक नियंत्रण सामग्री पर मिश्रित सकारात्मक नियंत्रण के रूप में ई. faecium.

QC परिणाम के लिए उपयुक्त परीक्षण की स्थिति, विशेष रूप से उन प्रभावित संकरण तंगी और कोशिका दीवार पैठ के लिए निगरानी करने में सक्षम हो, के बाद से PNA पद्धति कोशिका दीवार पैठ अनुकूलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है चाहिए

6. वर्ण - संकर करना

  1. की एक बूंद जोड़ें faecalis / ँ PNA धब्बा के साथ खुर्दबीन स्लाइड पर अच्छी तरह से करने के लिए .
  2. Coverslip जोड़ें. हवाई बुलबुले से बचें.
  3. 30 के लिए सेते ± 5 मिनट. 55 में ± 1 ° C हीटिंग प्लेट पर
  4. ऊष्मायन जगह स्लाइड वाहक में स्लाइड्स के बाद

7. कड़े धो

  1. 55 में preheated धो समाधान में विसर्जित स्लाइड वाहक डिग्री सेल्सियस और ध्यान से coverslip हटायें. अक्सर, coverslip धीरे से धो समाधान में स्लाइड आंदोलन बंद स्लाइड. कभी कभी, coverslip धीरे संदंश के साथ होना चाहिए बंद धक्का दिया.
  2. 30 धोने के लिए समाधान ± 5 मिनट में सेते हैं. 55 में 1 ± ° सी.
  3. धोने के समाधान से स्लाइड्स निकालें
  4. शुष्क हवा करने के लिए स्लाइड की अनुमति दें

8. बढ़ते

  1. प्रत्येक स्लाइड के लिए बढ़ते मध्यम की एक बूंद जोड़ें
  2. Coverslip जोड़ें. हवाई बुलबुले से बचें.
  3. 2 घंटे के भीतर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर स्लाइड की जांच करना.
  4. स्लाइड्स को बेनकाब करने के लिए सूरज की रोशनी या अन्य मजबूत प्रकाश स्रोतों प्रत्यक्ष रूप में इस प्रतिदीप्ति शमन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं मत करो.

9. परिणामों की व्याख्या

प्रतिदीप्ति स्लाइड परीक्षा के लिए इस्तेमाल सूक्ष्मदर्शी AdvanDx दोहरी बैंड फ़िल्टर और एक 60x या 100x तेल उद्देश्य के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए. QC स्लाइड्स पहले जांच की जानी चाहिए की पुष्टि करने के लिए कि संकरण होती थी ई.. faecalis उज्ज्वल हरी फ्लोरोसेंट cocci के रूप में देखने के कई क्षेत्रों में दिखाई देते हैं और ई. faecium चमकदार लाल cocci के रूप में दिखाई देगा चाहिए. गैर enterococci नियंत्रण स्लाइड nonfluorescent दिखाई देनी चाहिए. नियंत्रण प्रणाली में की पुष्टि करने के बाद, रोगी स्लाइड जांच की जा सकती है. कम रक्त fil पहलेमी लाल दिखाई, लेकिन चमकदार लाल और हरे cocci काफी स्पष्ट हो जाएगा.

चित्रा 1
चित्रा 1 हरी सकारात्मक ई. के प्रतिनिधि उदाहरण faecalis (बाएं), लाल सकारात्मक ई. (मध्य) faecium, और नकारात्मक परीक्षण के परिणाम (दाएं).

10. प्रतिनिधि परिणाम

तीन संस्थानों को एक बहु केंद्र नैदानिक ​​मूल्यांकन इस PNA मछली दाग ​​और छोटा 1.5 घंटे प्रोटोकॉल कि बस की समीक्षा किया गया है एक 2.5 घंटे प्रोटोकॉल की तुलना परीक्षण में शामिल थे. जोड़े और जंजीरों में 152 दिनचर्या ग्राम सकारात्मक cocci की कुल (GPC) सकारात्मक रक्त संस्कृति बोतलें अध्ययन में शामिल थे. समझौते के संशोधित परिणाम के बीच 100% (152/152) और ई. के लिए मूल परख प्रक्रिया थी / faecalis ँ PNA मछली: 41/41 ई. faecalis; 33/33 अन्य enterococci और 78/78 अन्य GPC (1 टेबल). यह धुंधला विधि (तालिका 2) इस चिकित्सीय परीक्षण के दौरान उत्तम संवेदनशीलता और विशिष्टता थी.

नियमित तरीके ई. / faecalis ँ PNA मछली मानक प्रक्रिया ई. / faecalis ँ PNA मछली लघु प्रक्रिया
ई. faecalis 41 41 (ग्रीन सकारात्मक) 41 (ग्रीन सकारात्मक)
ई. faecium 27 27 (रेड सकारात्मक) 27 (रेड सकारात्मक)
ई. casseliflavus 2 2 (लाल सकारात्मक) 2 (लाल सकारात्मक)
ई. gallinarum 2 2 (लाल सकारात्मक) 2 (लाल सकारात्मक)
अन्य Enterococcus एसपीपी. 2 2 (लाल सकारात्मक) 2 (लाल सकारात्मक)
एस निमोनिया 17 17 (नकारात्मक) 17 (नकारात्मक)
एस viridans 33 33 (नकारात्मक) 33 (नकारात्मक)
एस mitis 1 1 (नकारात्मक) 1 (नकारात्मक)
एस pyogenes 3 3 (नकारात्मक) 3 (नकारात्मक)
एस बोविस 2 2 (नकारात्मक) 2 (नकारात्मक)
एस salivarius 1 1 (नकारात्मक) 1 (नकारात्मक)
एस sanguinis 2 2 (नकारात्मक) 2 (नकारात्मक)
एस agalagtae 7 7 (नकारात्मक) 7 (नकारात्मक)
अन्य स्ट्रैपटोकोकस एसपीपी. 7 7 (नकारात्मक) 7 (नकारात्मक)
Abiotrophia एसपीपी. 3 3 (नकारात्मक) 3 (नकारात्मक)
Peptostrepococcus एसपीपी. 2 2 (नकारात्मक) 2 (नकारात्मक)
कुल 152 152/152
100% करार
152/152
100% करार

जीवाणुओं की तालिका 1. लिस्टिंग दोनों (2.5hr) मानक और तेजी से प्रोटोकॉल (1.5 घंटे) का उपयोग कर परीक्षण किया गया.

संवेदनशीलता E.faecalis संवेदनशीलता अन्य Enterococcus एसपीपी. विशेषता
100% (41/41)
95% CI (93.0-100)
100% (33/33) 33/33
95% CI (91.3-100)
100% (78/78)
95% CI (96.2-100)

टेबल 2 और 1.5 घंटे PNA मछली प्रोटोकॉल की संवेदनशीलता और विशिष्टता.

Discussion

ई. enterococcus के लिए / faecalis ँ PNA मछली परख पहचान मानक संस्कृति तरीकों की तुलना में 2-3 दिन पहले प्रदान कर सकते हैं. परख के लिए छोटा प्रक्रिया (1.5 hourr) तेजी से पहचान की है कि रोगाणुरोधी चिकित्सा और रोगी परिणाम के लिए एक बेहतर दृष्टिकोण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करता है. एक अध्ययन करने के लिए इस समर्थन फॉरेस्ट, एट अल. (6) द्वारा किया गया था. 2005 में शुरुआत लगातार दो वर्षों में सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला जोड़े और जंजीरों में ग्राम सकारात्मक cocci पहचान विधियों द्वारा पारंपरिक सूक्ष्मजीवविज्ञानी रक्त संस्कृति की बोतलों में बढ़ रही है और 2006 में ई. जोड़ने / faecalis ँ PNA मछली. इसके अलावा एक उपचार संस्थानों रोगाणुरोधी टीम (AMT) द्वारा विकसित एल्गोरिथ्म के प्रभावी ढंग से PNA मछली समय पर ढंग से प्रयोगशाला द्वारा उत्पन्न डेटा का उपयोग करने के लिए. प्राथमिक मूल्यांकन परिणाम था रक्त संस्कृति से समय से पहले प्रभावी antimicrobial उपचार के कार्यान्वयन के लिए आकर्षित और बाद PNA मछली प्रयोगशालाओं वर्कफ़्लो में स्थापित किया गया था. बीमारी, रोगी स्थान और अनुभवसिद्ध रोगाणुरोधी चिकित्सा की गंभीरता को मापा गया. Bacteremia enterococcal अधिग्रहीत अस्पताल के साथ 224 रोगियों की कुल पूर्व हस्तक्षेप की अवधि में और 129 PNA मछली अवधि में 95 के साथ मूल्यांकन किया गया. PNA मछली ई. पहचान faecalis 3 पारंपरिक संस्कृतियों (1.1 बनाम 4.1 दिनों, पी <0.001) से पहले के दिनों. PNA मछली ई. faecium एक औसत 2.3 दिनों पहले पहचान (1.1 बनाम 3.4 दिनों, <.001 पी) और किया गया था करने के लिए प्रभावी उपचार (1.3 बनाम 3.1 दिनों, 0.001 <पी) की शुरुआत समय में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कटौती के साथ जुड़ा हुआ है और 30 दिन कम मृत्यु दर (26% बनाम 45%, पी = 0.04). इस समूह ने निष्कर्ष निकाला है कि ई. एक AMT उपचार एल्गोरिथ्म के साथ संयोजन के रूप में / faecalis ँ PNA मछली परख ई. faecium अधिग्रहीत bacteremia अस्पताल के साथ रोगियों के लिए उपयुक्त अनुभवसिद्ध रोगाणुरोधी चिकित्सा के पहले दीक्षा में हुई .

  1. अभिकर्मकों के बाद समाप्ति तिथियाँ लेबल और अभिकर्मकों पर मुद्रित किसी भी तरह से संशोधित नहीं किया जाना चाहिए नहीं किया जाना चाहिए. वे उपयोग में नहीं है जब रेफ्रिजरेटर में रह सकता है या वे शक्ति खो सकता है चाहिए.
  2. रक्त संस्कृति की बोतलें नमूने से पहले मिलाया जाना चाहिए.
  3. यह महत्वपूर्ण है क्योंकि यह स्लाइड्स के बीच सामग्री के पार संदूषण के कारण, हो सकता है या अभिकर्मक के संदूषण के कारण की अनुमति नहीं dropper बोतल टिप को छूने के लिए एक रक्त धब्बा.
  4. सुनिश्चित करें कि पानी स्नान और हीटिंग ब्लॉक निरंतर डिग्री सेल्सियस 55 पर बनाए रखा जाता है
  5. दोहरी बैंड फ़िल्टर या रंग स्पष्ट रूप से discerned नहीं किया जाएगा के अलावा अन्य मौजूद फिल्टर्स का इस्तेमाल मत करो.
  6. खुर्दबीन माइक्रोस्कोप स्लाइड्स या संकरण है घटित नहीं होगा की तुलना में अन्य स्लाइड्स का उपयोग नहीं है.
  7. यह महत्वपूर्ण है कि खुर्दबीन ठीक से कार्य कर रहा है. सुनिश्चित करें कि खुर्दबीन बल्ब उपयोग के लिए घंटे की स्वीकृत संख्या के भीतर है.
  • कुछ दुर्लभ घटनेवाला Enterococcus प्रजातियों PNA जांच ई. asinii, E.dispar, ई. haemoperoxidus, ई. cecorum, ई. columbae, ई. saccharolyticus, ई. solitarius और ई जैसे अन्य Enterococcus प्रजातियों, hybridizing द्वारा पता नहीं sulfurous.
  • ई. moraviensis ई. के रूप में पहचान की है अनुक्रम समानता के कारण faecalis.
  • स्ट्रैपटोकोकस anginosus के कुछ उपभेदों एक झूठी हरी सकारात्मक अनुक्रम समानता के कारण प्रतिदीप्ति उत्पादन.
  • VersaTREK रक्त संस्कृति बोतलें नैदानिक ​​अध्ययन के दौरान मूल्यांकन किया गया. ई. का पता लगाने के प्रदर्शन faecalis और अन्य Enterococcus एसपीपी. VersaTREK रक्त संस्कृति बोतलें के साथ अज्ञात है.
  • झूठी सकारात्मक हरी autofluorescence अगर एक मानक FITC फ़िल्टर दोहरी बैंड फ़िल्टर के बजाय प्रयोग किया जाता है हो सकता है.
  • झूठी नकारात्मक परिणामों कभी कभी मिश्रित वृद्धि के कारण है या परख तकनीक में त्रुटि के कारण हो सकता है.
  • और उपकरण इस्तेमाल के प्रकार की स्थिति प्राप्त छवि के दृश्य उपस्थिति को प्रभावित करेगा. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के प्रकार कार्यरत हैं, प्रकाश स्रोत और कोशिकाओं में rRNA के स्तर के लिए varydue सकता है
  • ठोस मीडिया पर अलगाव के अन्य जीवों के साथ मिश्रित विकास को अंतर और सकारात्मक रक्त एक नकारात्मक परिणाम उपज संस्कृतियों की पहचान की जरूरत है.
  • उत्पाद रक्त संस्कृतियों की तुलना में अन्य नमूनों के साथ नहीं किया गया पुष्टि की है.

Disclosures

इस वीडियो लेख के उत्पादन AdvanDx द्वारा प्रायोजित किया गया था. बेंजामिन क्रिस्टल AdvanDx, जो इस लेख में प्रयुक्त उपकरण और अभिकर्मकों बनाता के एक कर्मचारी है.

Acknowledgments

अध्ययन AdvanDx द्वारा प्रायोजित किया गया.

Materials

Reagents

E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:

  • Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent.
  • E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide.
  • 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent
  • Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol
  • Quality control slides
  • AdvanDX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, (2002).
  2. Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, (2003).
  3. Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, (2005).
  4. Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
  5. Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
की पहचान के लिए एक 1.5 घंटो प्रक्रिया<em> Enterococcus</em> प्रजाति सीधे रक्त संस्कृतियों से
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).More

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter