Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

1,5 час порядок идентификации Enterococcus Виды Непосредственно из культуры крови

doi: 10.3791/2616 Published: February 10, 2011

Summary

Быстрый протокол для непосредственной идентификации Enterococcus фекальный и другие виды Enterococcus с положительной культуры крови с использованием пептидов нуклеиновых кислот флуоресцентного анализа на месте гибридизация (FISH ПНА).

Abstract

Энтерококки являются частой причиной бактериемии с Е. фекальный быть доминирующих видов следуют E. faecium. Потому что устойчивость к ампициллину и ванкомицину в E. фекальный еще необычного по сравнению с сопротивлением в E. faecium, развитие экспресс-тестов позволяет дифференциации между видами энтерококков имеет важное значение для соответствующей терапии и сопротивления наблюдения. E. фекальный OE ПНА FISH анализа (AdvanDx, Woburn, MA) использует видоспецифические пептидных нуклеиновых кислот (ПНК) зондов в флуоресценции на месте формате гибридизации и предлагает время результаты 1,5 часа и потенциальных предоставления важной информации для видоспецифические лечение. Многоцентровое исследования проводились для оценки производительности 1,5 часа E. фекальный / OE ПНА FISH процедуры по сравнению с оригинальной 2,5 часа процедура анализа и стандартные методы бактериологии для идентификации энтерококков прямо из бутылки положительные культуры крови.

Protocol

1. Коллекция образцов и подготовка

  1. Сбор венозной крови от пациентов с подозрением на сепсис и поставить на два BACTEC (BD, Sparks, MD) бутылки посев крови, один аэробных и анаэробных один, а в составе одного крови культуре множество.
  2. Место бутылок в 9240 BACTEC инструментом при температуре 35 ° C.
  3. Инкубируйте пока прибор срабатывает сигнал тревоги в связи с ростом организмов в бутылке культуры крови.
  4. Удалите бутылку из инструмента культуры крови.

2. Подготовка реагентов До окрашивания

  1. Подготовка промывочного раствора путем добавления 4 мл 60x промывочного раствора затем 240 мл свежей деионизированной или дистиллированной воды непосредственно к Окрашивание антенны.
  2. Положите окрашивания блюдо в 55 ° С водяной бане до теплого.
  3. Храните оставшийся концентрат на 2-8 ° C.
  4. Удалить Монтаж Средний из холодильника и нагреться до комнатной температуры.

3. Грамм окрашивания

  1. Аккуратно водоворот бутылка крови культуры.
  2. Использование игл и шприцев или субкультивирования аппарата, удаления крови (приблизительно 5 мл) из бутылки и поместить в стерильный винт ограничен трубки.
  3. Использование стерильной пипетки, место одной большой капли крови на микроскопический слайд стекла.
  4. Воздух сухой слайд и исправить в метаноле в течение 10 секунд.
  5. Разрешить слайд высохнуть на воздухе.
  6. Выполните по Граму мазке крови, чтобы определить морфологию организма растет в бутылке культуры крови.
  7. Использование линз нефти погружения, просматривать слайд. Грамположительные кокки в парах и короткие цепочки наблюдается на Граму является наиболее соответствует энтерококков видов.
  8. Это Граму результат затем проходит выбор надлежащего комплекта FISH зонда ПНА использовать для бактериальных идентификации. Эта кровь культуры будет окрашивали Е. фекальный / OE ПНА FISH пятно.

4. ПНА FISH пятно

  1. Смешайте трубки, содержащей кровь мягко закрученной до мазка подготовки.
  2. Поместите одну каплю Фиксация Решение о яме стекло микроскопа FISH ПНА.
  3. Передача 10 мкл или одна маленькая капля из трубки с положительной культуры крови к фиксации решения и аккуратно перемешать для эмульгирования.
  4. Fix мазков при помощи их нагревания в течение 20 мин. при 55 ° С на нагревательной пластине.

5. Материал контроля качества

Одним из положительных и один отрицательный слайд контроля качества должны быть проверены с каждой серией слайдов для окрашивания.

  1. Используйте Е. фекальный / OE управления Слайды приобрести у AdvanDx для этой цели или готовить мазки из жидкой культуры ведения штаммов E. фекальный и E. faecium в качестве положительного контроля либо на отдельных слайдов или смешанный на один слайд и бактерии рода стафилококки или стрептококки, как негативного материала управления.

Результаты контроля качества должны быть в состоянии контролировать соответствующие условия для тестирования, особенно те, которые затрагивают строгости гибридизации и проникновения клеточной стенки, так как ПНА методология призвана оптимизировать проникновение клеточной стенки

6. Гибридизация

  1. Добавьте одну каплю Е. фекальный / OE ПНА хорошо на предметное стекло с мазком.
  2. Добавить покровное. Избегайте воздушных пузырьков.
  3. Инкубировать 30 ± 5 мин. при 55 ± 1 ° С при нагреве пластины
  4. После инкубации место слайдов в слайд перевозчика

7. Строгие Вымойте

  1. Погрузите перевозчика слайда в разогретой промывочного раствора при 55 ° С и тщательно удалить покровное. Часто, покровное соскальзывает, осторожно агитацию слайда в промывочного раствора. Иногда, покровное должно быть мягко оттолкнулся щипцами.
  2. Инкубируйте в промывочного раствора в течение 30 ± 5 мин. при 55 ± 1 ° C.
  3. Удалить слайды из промывочного раствора
  4. Разрешить слайд высохнуть на воздухе

8. Монтаж

  1. Добавьте одну каплю Монтаж среднего до каждого слайда
  2. Добавить покровное. Избегайте воздушных пузырьков.
  3. Изучить скользить по флуоресцентного микроскопа в течение 2 часов.
  4. Не подвергайте слайды прямых солнечных лучей или других сильных источников света, так как это может привести к тушению флуоресценции.

9. Интерпретация результатов

Флуоресцентный микроскоп используется для слайд экспертизы должны быть оборудованы AdvanDx Двойной Фильтр полосы и 60x или 100x нефти цели. QC слайды должны быть рассмотрены первые подтвердить, что гибридизация имели место. E. фекальный должен выглядеть ярко-зеленого флуоресцентного кокки в нескольких полях зрения и faecium Э. появится как ярко-красный кокки. Номера для энтерококков управления слайд должен появиться nonfluorescent. После подтверждения система контроля, пациент слайды могут быть рассмотрены. Сначала кровь филм появится красноватый, но яркий красный и зеленый кокки будет вполне очевидной.

Рисунок 1
Рисунок 1. Типичными примерами зеленый-положительных Е. фекальный (слева), красный положительный E. faecium (в центре) и отрицательных (справа) результаты испытаний.

10. Представитель Результаты

Три учреждения были включены в многоцентровое клиническое исследование оценки этой рыбы ПНА пятна и сравнивая 2,5 часа протокола к укороченной 1,5 часа протокол, который только что был рецензирован. В общей сложности 152 рутинных грамположительных кокков в парах и цепи (ГПХ) положительные бутылки культуры крови были включены в исследования. Существовал 100% (152/152) соглашение между результатами модифицированы и оригинальная методика анализа для E. фекальный / OE ПНА FISH: 41/41 E. фекальный; 33/33 других энтерококков и других GPC 78/78 (табл. 1). Этот метод окрашивания был изысканной чувствительностью и специфичностью в течение этого клинического исследования (табл. 2).

Рутинные методы Э. фекальный / OE ПНА FISH Стандартная процедура Э. фекальный / OE ПНА FISH Короткая процедура
Э. фекальный 41 41 (Зеленый Положительные) 41 (Зеленый Положительные)
E. faecium 27 27 (Красный Положительные) 27 (Красный Положительные)
Е. casseliflavus 2 2 (Красный Положительные) 2 (Красный Положительные)
Е. gallinarum 2 2 (Красный Положительные) 2 (Красный Положительные)
Другие Enterococcus sрр. 2 2 (Красный Положительные) 2 (Красный Положительные)
С. пневмонии 17 17 (Negative) 17 (Negative)
С. viridans 33 33 (Negative) 33 (Negative)
С. Mitis 1 1 (Negative) 1 (Negative)
S. pyogenes 3 3 (Negative) 3 (Negative)
С. Bovis 2 2 (Negative) 2 (Negative)
С. salivarius 1 1 (Negative) 1 (Negative)
С. sanguinis 2 2 (Negative) 2 (Negative)
С. agalagtae 7 7 (Negative) 7 (Negative)
Другие стрептококки. 7 7 (Negative) 7 (Negative)
Abiotrophia sрр. 3 3 (Negative) 3 (Negative)
Peptostrepococcus sрр. 2 2 (Negative) 2 (Negative)
Общий 152 152/152
100% Соглашения
152/152
100% Соглашения

Таблица 1. Листинг бактерий испытания с использованием как стандартных (2.5hr) и быстрый (1,5 часа) протоколу.

Чувствительность E.faecalis Чувствительность Другие Enterococcus sрр. Специфичность
100% (41/41)
95% доверительный интервал (93.0-100)
100% (33/33) 33/33
95% доверительный интервал (91.3-100)
100% (78/78)
95% доверительный интервал (96.2-100)

Таблица 2. Чувствительность и специфичность 1,5 часа протокол FISH ПНА.

Discussion

E. фекальный / OE ПНА FISH анализ для энтерококков может обеспечить идентификацию 2-3 дней раньше, чем стандартные методы культуры. Укороченной процедуре анализа (1,5 hourr) обеспечивает быструю идентификацию, которая может быть использована для лучшего подхода к антибактериальной терапии и пациента результат. Одно из исследований в поддержку этого была выполнена Форрест, и др.. (6). В течение двух лет подряд, начиная с 2005 года микробиологической лаборатории определили грамположительных кокков в пары и цепи, растущих в бутылках посев крови обычными микробиологическими методами и в 2006 году, добавив Е. фекальный / OE ПНА FISH. Кроме лечения алгоритма, разработанного специалистами учреждений антимикробных команды (AMT), чтобы эффективно использовать FISH ПНА данные, полученные в лаборатории в своевременной манере. Первичная оценка результата было время от посева крови привлечь к реализации эффективной антибактериальной терапии до и после ПНА FISH была учреждена в рабочий процесс лабораторий. Тяжесть болезни пациента местоположение и эмпирической антибактериальной терапии были измерены. Общей сложности 224 пациентов с больницы приобрели энтерококков бактериемии были оценены с 129 в до вмешательства период и 95 в период FISH ПНА. ПНА FISH определены E. фекальный 3 дня раньше, чем обычных культур (1,1 против 4,1 дней, р <0,001). ПНА FISH определены E. faecium среднем 2,3 дня раньше (1,1 против 3,4 дней, р <0,001) и был связан со статистически существенное сокращение времени начала эффективной терапии (1,3 против 3,1 дней, р <0,001) и сократились на 30 день смертности (26% против 45%, р = 0,04). Это группа пришла к выводу, что E. фекальный / OE ПНА FISH анализа в сочетании с AMT алгоритм лечения привели к более ранним началом соответствующей эмпирической антибактериальной терапии у пациентов с больницы приобрели E. faecium бактериемии.

  1. Реагенты не следует использовать после даты истечения срока действия напечатаны на этикетках и реагенты не должны быть изменены в любом случае. Они должны находиться в холодильнике, когда не используется, или они могут потерять потенцию.
  2. Кровь бутылки культуры нуждаются в смешанных до отбора проб.
  3. Важно, чтобы не допустить наконечник флакона на ощупь мазке крови, потому что это может стать причиной перекрестного загрязнения материала между слайдами, или вызвать загрязнение реагента.
  4. Убедитесь, что водяной бане и отопления блока поддерживается при постоянной температуре 55 ° C.
  5. Не используйте фильтры, кроме двойного Фильтр полосы или цвета не будут четко различить.
  6. Не используйте предметные стекла, кроме микроскопа слайды или гибридизации не произойдет.
  7. Очень важно, чтобы микроскоп работает нормально. Убедитесь, что лампа микроскопа в рамках утвержденного количества часов для использования.
  • Некоторые редкие встречающиеся виды Enterococcus не обнаруживаются зонда ПНА гибридизации с другими видами Enterococcus, таких как E. asinii, E.dispar, Е. haemoperoxidus, Е. cecorum, Е. columbae, Е. saccharolyticus, Е. solitarius и Е . сернистого.
  • Е. moraviensis определяется как E. фекальный из-за последовательности сходство.
  • Некоторые штаммы Streptococcus anginosus производить ложные положительные зеленый флуоресценции из-за последовательности сходство.
  • VersaTREK бутылки посев крови не были оценены во время клинических исследований. Производительность для обнаружения E. фекальный и других Enterococcus sрр. с бутылками VersaTREK посева крови неизвестны.
  • Ложное срабатывание зеленый аутофлюоресценция может произойти, если стандартные FITC фильтр используется вместо двойного фильтра Band.
  • Ложные отрицательные результаты могут часто возникать из-за смешанных роста или из-за ошибки в анализе техники.
  • Типа и состояния приборы, используемые будет влиять на внешний вид изображения получены. Флуоресценции может varydue на тип микроскопа работу, источник света и уровень РНК в клетках
  • Изоляция на твердых средах необходимо дифференцировать смешанные роста с другими организмами и выявления положительных культур крови приносит отрицательный результат.
  • Продукт не был подтвержден в образцах крови, чем другие культуры.

Disclosures

Производство видео-статья была организована AdvanDx. Бенджамин Кристалл сотрудник AdvanDx, кто делает инструменты и реактивы, используемые в этой статье.

Acknowledgments

Исследования были авторами которого AdvanDx.

Materials

Reagents

E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:

  • Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent.
  • E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide.
  • 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent
  • Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol
  • Quality control slides
  • AdvanDX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, (2002).
  2. Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, (2003).
  3. Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, (2005).
  4. Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
  5. Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
1,5 час порядок идентификации<em> Enterococcus</em> Виды Непосредственно из культуры крови
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).More

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter