Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Ett 1,5 timme Förfarande för identifikation av Enterococcus Arter Direkt från blododlingar

doi: 10.3791/2616 Published: February 10, 2011

Summary

En snabb protokoll för direkt identifiering av Enterococcus faecalis och andra arter Enterococcus från en positiv blododling med hjälp av en peptid nukleinsyra fluorescent in situ hybridisering analys (PNA fisk).

Abstract

Enterokocker är en vanlig orsak till bakteriemi med E. faecalis är den dominerande arten följt av E. faecium. Eftersom resistens mot ampicillin och vankomycin i E. faecalis fortfarande är ovanligt jämfört med motstånd i E. faecium, är utvecklingen av snabbtest tillåta differentiering mellan enterococcal arter viktig för lämplig behandling och motstånd övervakning. E. faecalis OE PNA FISH analys (AdvanDx, Boston, MA) använder artspecifika syra peptid nukleinsyra (PNA) sonder i en fluorescens in situ hybridisering format och ger en tid att resultat på 1,5 timmar och den potential att ge viktig information för artspecifika behandling. Multicenter studier utfördes för att utvärdera resultaten av den 1,5 timme E. faecalis / OE PNA FISH förfarande jämfört med den ursprungliga 2,5 timme analysprocedur och till standard bakteriologi metoder för identifiering av enterokocker direkt från en positiv blododling flaska.

Protocol

1. Provtagning och förberedelser

  1. Samla venöst blod från patienter som misstänks för sepsis och tas i två Bactec (BD, Sparks, MD) blododling flaskor, en aerob och en anaerob, tillsammans omfattande en uppsättning blododling.
  2. Placera flaskorna i Bactec 9240 instrumentet på 35 ° C.
  3. Inkubera tills instrumentet utlöser ett larm på grund av tillväxt av organismer i blododling flaskan.
  4. Ta bort flaskan från blododling instrumentet.

2. Beredning av reagenser innan färgning

  1. Bered tvättlösningen genom att tillsätta 4 mL 60x Tvättlösning följt av 240 ml rent avjoniserat eller destillerat vatten direkt till färgning skålen.
  2. Sätt färgning skålen i 55 ° C vattenbad till varmt.
  3. Förvara de återstående koncentrera vid 2-8 ° C.
  4. Ta bort Montering Medel ur kylskåpet och värmas upp till rumstemperatur.

3. Gram färgning

  1. Snurra flaskan blododling.
  2. Med hjälp av en nål och spruta eller en subkultur apparater, tvätta bort blodet (ca 5 ml) från flaskan och placera i ett sterilt skruv tak rör.
  3. Använd en steril pipett, placera en stor droppe blod på ett glas objektglas.
  4. Lufttorka i bilden och fixa i metanol i 10 sekunder.
  5. Låt bilden lufttorka.
  6. Gör en gramfärgning på blod filmen för att bestämma morfologi av organismen växer i blodet kulturen flaskan.
  7. Använda en lins oljeimmersion, visa bildspel. Grampositiva kocker i par och korta kedjor observerats på gramfärgning stämmer bäst överens med Enterococcus arter.
  8. Detta gramfärgning resultatet driver sedan valet av rätt PNA FISH Probe Kit använda för bakteriell identifiering. Detta blododling kommer färgas med E. faecalis / OE PNA FISH fläcken.

4. PNA FISH Stain

  1. Blanda röret med blod försiktigt genom att snurra innan smutskasta beredning.
  2. Placera en droppe Fixering lösningen på väl om en PNA FISH objektglas.
  3. Överför 10 mikroliter eller en liten droppe ur röret med positiv blododling till upptagningen lösning och blanda försiktigt så emulgera.
  4. Fäst utstryk genom att värma dem i 20 min. vid 55 ° C på en värmeplatta.

5. Kvalitetskontroll Material

En positiv och en negativ kvalitetskontroll bilden måste testas med varje sats diabilder för missfärgning.

  1. Använd E. faecalis / OE kontrollglas köpts från AdvanDx för detta ändamål eller förbereda utstryk från flytande kulturer av referens stammar av E. faecalis och E. faecium som positiv kontroll, antingen på separata diabilder eller blandas på en bild och Staphylococcus spp. eller Streptococcus spp. som negativa kontrollmaterial.

QC resultat bör kunna övervaka lämpliga testmetoder, särskilt de som berör hybridisering stringens och cellväggen penetration, eftersom PNA metodiken är utformad för att optimera penetration cellväggen

6. Hybridisering

  1. Tillsätt en droppe E. faecalis / OE PNA till brunnen på objektglas med cellprov.
  2. Lägg täckglas. Undvik luftbubblor.
  3. Inkubera i 30 ± 5 minuter. vid 55 ± 1 ° C på värmeplatta
  4. Efter inkubation placera bilder i bilden bärare

7. Strikta Tvätta

  1. Sänk bilden bärare i den förvärmda tvättlösningen vid 55 ° C och försiktigt bort täckglas. Ofta glider täckglas bort genom att försiktigt skaka bilden i tvättlösningen. Ibland måste täckglas försiktigt knuffade bort med pincett.
  2. Inkubera i tvättlösningen i 30 ± 5 minuter. vid 55 ± 1 ° C.
  3. Ta bort bilderna från den tvättlösning
  4. Låt bilden lufttorka

8. Montering

  1. Tillsätt en droppe monteringsmedium i varje bild
  2. Lägg täckglas. Undvik luftbubblor.
  3. Undersök glida på en fluorescensmikroskop inom 2 timmar.
  4. Utsätt inte glider för direkt solljus eller andra starka ljuskällor, eftersom detta kan leda till fluorescens härdning.

9. Tolkning av resultat

Den fluorescensmikroskop används för att glida undersökning skall vara utrustade med AdvanDx Dual Band Filter och en 60x eller 100x olja mål. QC glider bör undersökas först för att bekräfta att hybridisering skedde. E. faecalis ska visas som ljusa gröna fluorescerande kocker i flera synfält och E. faecium visas som röda kocker. Icke-enterokocker kontroll bilden ska visas nonfluorescent. Efter att ha bekräftat systemet i kontroller, kan patienten glider undersökas. Vid första blodet film kommer att visas rödaktiga men den ljusa röda och gröna kocker kommer att vara ganska uppenbart.

Figur 1
Figur 1. Representativa exempel på grön-positiva E. faecalis (vänster), röd positiv E. faecium (mitten) och negativa (höger) testresultat.

10. Representativa resultat

Tre institutionerna ingick i en multicenter klinisk studie som utvärderar detta PNA FISH fläcken och jämför en 2,5 timme protokoll till förkortade 1,5 timme protokoll som precis har granskats. Totalt 152 rutin grampositiva kocker i par och kedjor (GPC) var positiv blododling flaskor som ingår i studierna. Det var 100% (152/152) Avtal mellan resultaten av de ändrade och den ursprungliga analysen förfarande för E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis, 33/33 andra enterokocker och 78/78 andra GPC (tabell 1). Denna färgningsmetod hade utsökt känslighet och specificitet under denna studie (tabell 2).

Rutinmetoder E. faecalis / OE PNA FISH Standardförfarande E. faecalis / OE PNA FISH Kort Förfarande
E. faecalis 41 41 (Grön positiv) 41 (Grön positiv)
E. faecium 27 27 (Röd positiv) 27 (Röd positiv)
E. casseliflavus 2 2 (Röd positiv) 2 (Röd positiv)
E. gallinarum 2 2 (Röd positiv) 2 (Röd positiv)
Andra Enterococcus spp.. 2 2 (Röd positiv) 2 (Röd positiv)
S. pneumoniae 17 17 (Negativ) 17 (Negativ)
S. viridans 33 33 (Negativ) 33 (Negativ)
S. mitis 1 1 (Negativ) 1 (Negativ)
S. pyogenes 3 3 (Negativ) 3 (Negativ)
S. bovis 2 2 (Negativ) 2 (Negativ)
S. salivarius 1 1 (Negativ) 1 (Negativ)
S. sanguinis 2 2 (Negativ) 2 (Negativ)
S. agalagtae 7 7 (Negativ) 7 (Negativ)
Andra Streptococcus spp.. 7 7 (Negativ) 7 (Negativ)
Abiotrophia SPP. 3 3 (Negativ) 3 (Negativ)
Peptostrepococcus SPP. 2 2 (Negativ) 2 (Negativ)
Totalt 152 152/152
100%-avtalet
152/152
100%-avtalet

Tabell 1. Notering av bakterier testades med både standard (2.5hr) och snabb (1,5 h) protokollet.

Känslighet E.faecalis Känslighet Andra Enterococcus spp.. Specificitet
100% (41/41)
95% CI (93,0-100)
100% (33/33) 33/33
95% CI (91,3-100)
100% (78/78)
95% CI (96,2-100)

Tabell 2. Sensitivitet och specificitet på 1,5 timme PNA FISH protokoll.

Discussion

E. faecalis / OE PNA FISH analys för Enterococcus kan ge identifiering 2-3 dagar tidigare än vanliga kulturen metoder. Den förkortade förfarande för analysen (1,5 hourr) ger snabb identifiering som kan användas för ett bättre förhållningssätt till antimikrobiell behandling och patientens resultat. En studie för att stödja detta utfördes av Forrest, et al. (6). Under två på varandra följande år med början år 2005 mikrobiologiska laboratoriet identifierat grampositiva kocker i par och kedjor växer i flaskor blododling med konventionella mikrobiologiska metoder och under 2006 lägga till E. faecalis / OE PNA FISH. Förutom en behandling algoritm som utvecklats av institutionerna antimikrobiella team (AMT) att effektivt använda PNA FISH data som genereras av laboratoriet i god tid. Primärt utfall bedöms var tiden från blododling dra till genomförandet av effektiva antimikrobiell behandling före och efter PNA FISH instiftades i laboratorier arbetsflöde. Svårighetsgraden av sjukdomen, patientens läge och empirisk antimikrobiell behandling mättes. Totalt 224 patienter med vårdrelaterade enterococcal bakteriemi utvärderades med 129 i före interventionsperioden och 95 PNA FISH period. PNA FISH identifierade E. faecalis 3 dagar tidigare än traditionella kulturer (1,1 vs 4,1 dagar, p <0,001). PNA FISH identifierade E. faecium en median 2,3 dagar tidigare (1,1 vs 3,4 dagar, p <0,001) och var förknippat med statistiskt signifikanta sänkningar i tid för att initiera effektiv terapi (1,3 vs 3,1 dagar, p <0,001) och minskade 30 dagar mortalitet (26% vs 45%, p = 0,04). Denna grupp slutsatsen att E. faecalis / OE PNA FISH-analys i kombination med en AMT behandling algoritm resulterade i tidigare insättande av lämplig empirisk antimikrobiell behandling för patienter med vårdrelaterade E. faecium bakteriemi.

  1. Reagenser får inte användas efter utgångsdatum tryckt på etiketterna och reagenser inte bör ändras på något sätt. De bör vara kvar i kylskåpet när den inte används eller om de kan förlora potens.
  2. Blododling flaskor måste blandas före provtagningen.
  3. Det är viktigt att inte tillåta pipetten flaskans spets vidröra ett blodutstryk eftersom det kan orsaka korskontaminering av material mellan bilder, eller orsaka kontaminering av reagens.
  4. Se till vattenbadet och värmeblocket hålls på en konstant 55 ° C.
  5. Använd inte filter än de Dual Band Filter eller färger kommer inte att vara tydligt urskiljas.
  6. Använd inte objektglas än Objektglas eller hybridisering kommer inte att inträffa.
  7. Det är viktigt att mikroskop fungerar. Se till att mikroskopet lampan är inom den godkända antalet timmar för användning.
  • Några sällsynta förekommande Enterococcus arter är inte upptäcks av PNA sonden hybridisering med andra Enterococcus arter, såsom E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitarius och E . svavelhaltiga.
  • E. moraviensis identifieras som E. faecalis grund sekvens likheter.
  • Vissa stammar av Streptococcus anginosus ge en falsk grön positiv fluorescens grund sekvens likheter.
  • VersaTREK blododling flaskor har inte utvärderats i kliniska studier. Föreställningen att upptäcka E. faecalis och andra Enterococcus spp.. med VersaTREK flaskor blododling är okänd.
  • Falskt positiva gröna autofluorescens kan uppstå om en standard FITC-filter används i stället för Dual Band Filter.
  • Falskt negativa resultat kan sällan uppstå på grund av blandade tillväxt eller på grund av fel i analysen teknik.
  • Den typ och skick av använda instrument kommer att påverka utseendet på de erhållna bilden. Den fluorescens kan varydue till den typ av mikroskop som används, ljuskällan och nivån av rRNA i cellerna
  • Isolering på fasta medier behövs för att skilja blandas tillväxt med andra organismer och för att identifiera positiva blododlingar ger ett negativt resultat.
  • Produkten har inte validerats med andra exemplar än blododlingar.

Disclosures

Produktionen av denna video-artikeln var sponsrad av AdvanDx. Benjamin Crystal är anställd AdvanDx, som gör verktyg och reagens som används i denna artikel.

Acknowledgments

Studier sponsrade av AdvanDx.

Materials

Reagents

E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:

  • Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent.
  • E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide.
  • 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent
  • Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol
  • Quality control slides
  • AdvanDX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, (2002).
  2. Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, (2003).
  3. Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, (2005).
  4. Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
  5. Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
Ett 1,5 timme Förfarande för identifikation av<em> Enterococcus</em> Arter Direkt från blododlingar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).More

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter