Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Belirlenmesi için 1.5 Saat Usulü Enterococcus Türler

doi: 10.3791/2616 Published: February 10, 2011

Summary

In situ hibridizasyon tayininde floresan bir Peptid Nükleik Asit (PNA BALIK) kullanarak bir pozitif kan kültürü, Enterococcus faecalis ve diğer Enterococcus türleri doğrudan tanımlanması için hızlı bir protokoldür.

Abstract

Enterokoklar E. ile bakteriyemi yaygın bir nedenidir. faecalis, E. faecium baskın tür . Çünkü E. ampisilin ve vankomisine direnç faecalis, E. faecium direnci hala yaygın karşılaştırıldığında, enterokok türler arasındaki farklılaşmayı sağlayan hızlı testlerin geliştirilmesi, uygun tedavi ve direnç gözetim için önemlidir. E. faecalis OE PNA FISH testinin (AdvanDx, Woburn, MA) in situ hibridizasyon formatında türe özgü bir floresan peptid nükleik asit (PNA) problar kullanır ve 1,5 saat ve türe özgü önemli bilgiler veren potansiyel sonuçlarını bir süre sunuyor tedavi. Çok Merkezli 1.5 saatlik E. performansını değerlendirmek için çalışmalar yapıldı faecalis / OE PNA BALIK prosedürü orijinal 2,5 saat metodlara ve pozitif kan kültürü şişesi doğrudan enterokokların belirlenmesi için standart bakteriyoloji yöntemlerine göre.

Protocol

1. Örnek Toplama ve Hazırlama

  1. Sepsis şüphelenilen hastalarda venöz kan toplayın ve bir kan kültürü seti birlikte oluşan iki BACTEC (BD, Sparks, MD) kan kültürü şişeleri, bir aerobik ve anaerobik bir koymak.
  2. BACTEC 9240 araç içine yerleştirin şişeler 35 ° C
  3. Enstrüman kan kültürü şişesi organizmaların büyüme nedeniyle alarm tetiklenir kadar inkübe edin.
  4. Kan kültürü aracı şişe çıkarın.

2. Boyama için önce Reaktiflerin Hazırlanması

  1. 4 ml, 240 ml taze deiyonize veya distile su Boyama Bulaşık doğrudan takip 60x Yıkama Çözeltisi ekleyerek yıkama solüsyonu hazırlayın.
  2. Isıtmak için 55 ° C su banyosunda boyama kabına koyun.
  3. 2-8 kalan konsantre ° C depolayın
  4. Montaj Orta buzdolabından çıkartın ve oda sıcaklığında.

3. Gram Boyama

  1. Yavaşça girdap kan kültürü şişesi.
  2. , Bir iğne ve şırınga ya da bir alt kültüre aparatları kullanarak, kan (yaklaşık 5 ml), steril vida kapaklı tüp içinde şişe ve yerden kaldırmak.
  3. Steril bir pipet kullanarak, büyük bir damla kan bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin.
  4. Hava slayt kuru ve 10 saniye boyunca metanol düzeltmek.
  5. Hava kuru kaydırın İzin.
  6. Gram kan kültürü şişesi büyüyen organizmanın morfolojisini belirlemek için kan filmi leke gerçekleştirin.
  7. Immersiyon yağı lens kullanarak, slayt görünümünde. Çiftleri ve Gram boyama gözlenen kısa zincirleri Gram pozitif koklar enterokok türleri ile en tutarlı.
  8. Bu Gram boyama sonucu bakteriyel kimlik kullanmak için uygun PNA BALIK prob kiti seçimi sürücüler. Bu kan kültürü E. kullanılarak boyandı. faecalis / OE PNA BALIK leke.

4. Lekelere PNA BALIK

  1. Tüp kan içeren smear hazırlama önce dönen hafifçe karıştırın.
  2. Fiksasyon Çözüm PNA BALIK Mikroskop Slayt iyi bir damla yerleştirin.
  3. 10 mcL pozitif kan kültürü ile tüp ya da küçük bir damla Fixation Çözüm transferi ve emülsifiye hafifçe karıştırın.
  4. 20 dakika ısıtarak smear sabitleyin. 55 ° C ısıtma plakası.

5. Kalite Kontrol Malzeme

Bir pozitif ve bir negatif kalite kontrol slayt boyama slaytlar her parti ile test edilmelidir.

  1. E. kullanın. faecalis / OE Kontrol, bu amaç için AdvanDx satın alınan ya da E. referans suşları sıvı kültürlerden gelen smear hazırlamak Slaytlar faecalis ve E. faecium olarak ayrı slaytlar veya bir slayt ve Negatif Kontrol malzemesi olarak Staphylococcus spp Streptococcus spp karışık ya Pozitif Kontrol.

PNA metodoloji hücre duvarı penetrasyon optimize etmek için tasarlanmış olduğundan QC sonuçları, uygun test koşullarında, özellikle hibridizasyon darlığı ve hücre duvarı penetrasyon etkileyen izlemek için gerekir

6. Melezleme

  1. E. bir damla ekleyin faecalis / OE PNA smear ile mikroskop lamı üzerine iyi.
  2. Lamel ekleyin. Hava kabarcıkları kaçının.
  3. 30 inkübe ± 5 dk. 55 ± 1 ° C ısıtma plakası
  4. Slayt taşıyıcıya inkübasyon yer slaytlar ardından

7. Sıkı Yıkama

  1. Önceden ısıtılmış Yıkama Çözüm daldırın slayt taşıyıcı 55 ° C ve lamel dikkatlice çıkarın. Genellikle, lamel nazikçe yıkayın Çözüm slayt çalkalayarak slaytlar. Bazen, lamel forseps ile yavaşça itti olmalıdır.
  2. 30 yıkama çözüm ± 5 dakika inkübe edin. 55 ± 1 ° C
  3. Yıkama çözüm slaytları çıkarın
  4. Hava kuru slayt izin ver

8. Montaj

  1. Her bir slayt için bir damla Montaj Orta ekle
  2. Lamel ekleyin. Hava kabarcıkları kaçının.
  3. 2 saat içinde bir floresan mikroskop, slayt inceleyin.
  4. Slaytları floresan soğutulması için yol olarak güneş ışığı veya diğer güçlü ışık kaynaklarına doğrudan maruz bırakmayın.

9 - Sonuçların Yorumlanması

Slayt inceleme için kullanılan floresan mikroskop AdvanDx Dual Band Filtresi ve 60x veya 100x petrol amacı ile donatılmış olmalıdır. QC slaytlar bu hibridizasyon meydana geldi onaylamak için ilk incelenmiş olmalıdır E. faecalis bakış birden fazla alanlarda parlak yeşil floresan koklar gibi görünmelidir ve E. faecium parlak kırmızı koklar gibi görünecektir . Sigara enterokok kontrol slayt nonfluorescent görünmelidir. Kontroller sistem onayladıktan sonra, hasta slaytlar incelenebilir. İlk kan film kırmızımsı görünür ama parlak kırmızı ve yeşil koklar oldukça belirgin olacaktır.

Şekil 1
Yeşil-pozitif E. Şekil 1 Temsilcisi örnekler faecalis (solda), kırmızı pozitif E. faecium (orta) ve negatif (sağ) test sonuçları.

10 Temsilcisi Sonuçlar

Üç kurum, bu PNA BALIK leke değerlendirilmesi ve gözden geçirilmiştir kısaltılmış 1.5 saat protokol 2.5 saat protokol karşılaştıran bir çok merkezli bir klinik araştırmaya dahil edildi. 152 rutin Gram pozitif koklar çiftleri ve zincirleri olmak üzere toplam (GPC) pozitif kan kültürü şişeleri çalışmalar dahil edildi. % 100 (152/152) modifiye sonuçları arasındaki anlaşma ve E. için orijinal deneyi prosedürü vardı faecalis / OE PNA BALIK: 41/41 E. faecalis; 33/33 Diğer enterokoklar ve 78/78 Diğer GPC (Tablo 1). Bu boyama yöntemi bu klinik çalışma sırasında (Tablo 2) enfes bir duyarlılık ve özgüllük vardı.

Rutin Yöntemleri E. faecalis / OE PNA BALIK Prosedürü E. faecalis / OE PNA BALIK Kısa Prosedürü
E. faecalis 41 41 (Yeşil Pozitif) 41 (Yeşil Pozitif)
E. faecium 27 27 (Pozitif Kırmızı) 27 (Pozitif Kırmızı)
E. casseliflavus 2 2 (Pozitif Kırmızı) 2 (Pozitif Kırmızı)
E. gallinarum 2 2 (Pozitif Kırmızı) 2 (Pozitif Kırmızı)
Diğer Enterococcus spp. 2 2 (Pozitif Kırmızı) 2 (Pozitif Kırmızı)
S. pneumoniae 17 17 (Negatif) 17 (Negatif)
S. viridans 33 33 (Negatif) 33 (Negatif)
S. mitis 1 1 (Negatif) 1 (Negatif)
S. pyogenes 3 3 (Negatif) 3 (Negatif)
S. bovis 2 2 (Negatif) 2 (Negatif)
S. salivarius 1 1 (Negatif) 1 (Negatif)
S. sanguinis 2 2 (Negatif) 2 (Negatif)
S. agalagtae 7 7 (Negatif) 7 (Negatif)
Diğer Streptococcus spp. 7 7 (Negatif) 7 (Negatif)
Abiotrophia spp. 3 3 (Negatif) 3 (Negatif)
Peptostrepococcus spp. 2 2 (Negatif) 2 (Negatif)
Toplam 152 152/152
100% Anlaşması
152/152
100% Anlaşması

Tablo 1. bakteri Listeleme standart (2.5hr) ve hızlı (1,5 saat) protokolü kullanılarak test edilmiştir.

Hassasiyet E.faecalis Hassasiyet Diğer Enterococcus spp. Özgüllük
% 100 (41/41)
% 95 CI (93,0-100)
% 100 (33/33) 33 / 33
% 95 CI (91,3-100)
% 100 (78/78)
% 95 CI (96,2-100)

Tablo 2 - 1.5 saat PNA BALIK protokol duyarlılığı ve özgüllüğü .

Discussion

E. enterococcus faecalis / OE PNA FISH testinin standart kültür yöntemleri daha 2-3 gün önce kimlik sağlayabilir. Tayini için kısaltılmış bir prosedür (1.5 hourr), antimikrobiyal tedavi ve hasta sonucu daha iyi bir yaklaşım için kullanılabilecek hızlı bir şekilde tespit sağlar. Bunu desteklemek için bir çalışmada Forrest ve ark. (6) tarafından yapıldı. 2005 yılından itibaren birbirini takip eden iki yıl içinde mikrobiyoloji laboratuvarına konvansiyonel mikrobiyolojik yöntemlerle kan kültürü şişeleri büyüyen ve 2006 yılında E. ekleyerek çiftleri ve zincirleri Gram pozitif koklar tespit faecalis / OE PNA BALIK. Buna ek olarak kurumları antimikrobiyal ekibi (AMT) tarafından geliştirilen bir tedavi algoritması zamanında laboratuvar tarafından oluşturulan PNA BALIK verileri etkin bir şekilde kullanmak. Değerlendirilir Primer sonuç, kan kültürü zaman önce etkili antimikrobiyal tedavi uygulanması çizmek ve PNA BALIK laboratuarlar iş akışı içine tesis sonra oldu. Hastalık, hasta konumu ve ampirik antimikrobiyal tedavi şiddeti ölçüldü. Bakteriyemi enterokok elde edilen 224 hasta hastane ile toplam 129 ve 95 PNA BALIK dönemde müdahale öncesi dönemde değerlendirildi. PNA BALIK E. tespit geleneksel kültürlerin (1.1 vs 4.1 gün, p <0.001) daha önce faecalis 3 gün. PNA BALIK medyan 2.3 gün önce E. faecium tespit (1.1 vs 3.4 gün, p <0.001) ve etkili bir tedavi (1.3 ve 3.1 gün, p <0.001) başlatarak için zaman içinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma ile ilişkili ve 30 gün azaldı mortalite (% 26 vs% 45, p = 0.04). Bu grup sonucuna E. AMT bir tedavi algoritması ile birlikte faecalis / OE PNA FISH testinin elde edilen hastane ile bakteriyemi E. faecium hastalar için uygun ampirik antimikrobiyal tedavinin erken başlamasına yol açmıştır .

  1. Etiketleri ve reaktifler üzerinde yazılı olan son kullanma tarihleri, herhangi bir şekilde değiştirilmiş olmamalıdır sonra Reaktifler kullanılmamalıdır. Bunlar kullanılmadığı zaman buzdolabında kalmalıdır veya onlar potens kaybedebilirsiniz.
  2. Kan kültürü şişeleri örnekleme önce karıştırılması gerekmektedir.
  3. Bu malzeme slaytlar arasındaki çapraz kontaminasyon neden, ya da reaktif kontaminasyona neden olabilir çünkü kan yaymasında damlalıklı şişe ucu dokunmak için izin vermemesi için önemlidir.
  4. Su banyosu ve ısıtma bloğu sabit bir 55 ° C'de muhafaza edilir emin olun.
  5. Dual Band Filtresi veya renkler açıkça ayırt olmayacaktır dışında filtre kullanmayın.
  6. Mikroskop Slaytlar veya hibridizasyon olmayacağına dışında mikroskop lamı kullanmayın.
  7. Mikroskop düzgün çalıştığını önemlidir. Mikroskop ampul kullanımı için saat onaylanmış sayısı içinde olduğundan emin olun.
  • Bazı nadir meydana gelen Enterococcus türleri, E. asinii, E.dispar, E. haemoperoxidus, E. cecorum, E. columbae, E. saccharolyticus, E. solitariusa ve E gibi diğer Enterococcus türleri, literatürde PNA probu tarafından tespit edilmez . kükürtlü.
  • E. moraviensis E. olarak tanımlanır dizisi benzerlikleri nedeniyle faecalis.
  • Streptococcus anginosus bazı suşları dizisi benzerlikleri nedeniyle, sahte bir yeşil olumlu floresan üretir .
  • VersaTREK kan kültürü şişeleri klinik çalışmalar sırasında değerlendirilir değildi. E. algılamak için performans faecalis ve diğer Enterococcus spp. VersaTREK kan kültürü şişeleri ile bilinmemektedir.
  • Yanlış pozitif yeşil otofloresans standart bir FITC filtresi Dual Band Filtresi yerine kullanılması durumunda ortaya çıkabilir.
  • Yanlış negatif sonuçlar nadiren karışık büyüme nedeniyle veya tahlil tekniği hata nedeniyle oluşabilir.
  • Kullanılan enstrümantasyon tipine ve durumuna, elde edilen görüntünün görünümünü etkiler. Floresan kullanılan mikroskop, ışık kaynağı ve hücrelerde rRNA düzeyi varydue olabilir
  • Katı ortam izolasyonu, diğer organizmalar ile karışık bir büyüme ayırt etmek ve negatif sonuç veren pozitif kan kültürleri tanımlamak için ihtiyaç vardır.
  • Ürün, kan kültürlerinden başka örnekler ile geçerli olmamıştır.

Disclosures

Bu video-makale üretim AdvanDx sponsor oldu. Benjamin Kristal, bu makalede kullanılan araçlar ve reaktifler yapar AdvanDx, bir çalışanın.

Acknowledgments

Çalışmalar AdvanDx tarafından desteklenen edildi.

Materials

Reagents

E. faecalis/– PNA FISH is comprised of the following kit components:

  • Fixation Solution Fixation Solution 3 mL phosphate-buffered saline with detergent.
  • E. faecalis/– PNA E. faecalis/– PNA 1.5 mL PNA probes in hybridization. solution. Contains 30% formamide.
  • 60x Wash Solution 60x Wash Solution 50 mL Tris-buffered saline with detergent
  • Mounting Medium Mounting Medium 3 mL photobleaching inhibitor in Glycerol
  • Quality control slides
  • AdvanDX

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures by dual color fluorescence in situ hybridization using PNA probes. Oliveira, K., Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Haase, G., Weber-Heynemann, J., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Stender, H. 42rd Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, San Diego, (2002).
  2. Multicenter evaluation of E. faecalis PNA FISH for rapid identification and differentiation of Enterococcus faecalis and other Enterococcus species directly from positive blood cultures. Chapin, K. C., Musgnug, M. C., Oliveira, K., DeGirolami, P. C., Dakos, J., Johansen, J. T., Procop, G. W., Wilson, D., Padilla, E., Gonzalez, V., Stender, H. 103rd Annual Meeting of American Society, 2003, Washington DC, (2003).
  3. Direct identification of Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, and Candida albicans from blood cultures using fluorescence in situ hybridization with nucleic acid probes. Rausei, V., Youssef, E., Morgan, M. 104th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2005, New Orleans, LA, (2005).
  4. Validation of S. aureus PNA FISH, E. faecalis PNA FISH & C. albicans PNA FISH for Rapid Identification of Positive Blood Culture Bottles. Novak-Weekley, S. M., LaForga, M., Carey, L., Frazier, L. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
  5. Rapid Identification of Enterococcus Species in Positive Blood Cultures with Therapeutic Implications. Johnson, J. K., Roberts, A. A., Forrest, G. N., Lincalis, D. P., Venezia, R. A. 106th Annual Meeting of American Society for Microbiology, 2006, Orlando, FL, (2006).
Belirlenmesi için 1.5 Saat Usulü<em> Enterococcus</emDoğrudan Kan Kültürleri> Türler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).More

Morgan, M. A., Marlowe, E., Novak-Weekly, S., Miller, J., Painter, T., Salimnia, H., Crystal, B. A 1.5 Hour Procedure for Identification of Enterococcus Species Directly from Blood Cultures. J. Vis. Exp. (48), e2616, doi:10.3791/2616 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
simple hit counter