Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

Published: March 1, 2011 doi: 10.3791/2619

Summary

Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.

Abstract

Om te oefenen hun functie lymfocyten moet het bloed te verlaten en in verschillende weefsels in het lichaam migreren. Lymfocyten hechting op endotheliale cellen en weefsels extravasatie is een complex proces gecontroleerd door verschillende adhesiemoleculen (homing-receptoren) uitgedrukt op lymfocyten en hun respectieve liganden (addressins) getoond op endotheelcellen 1 2. Ook al is de functie van deze receptoren hechting kan gedeeltelijk worden bestudeerd ex vivo, de ultieme test voor hun fysiologische relevantie is om hun rol te evalueren tijdens de in-vivo-lymfocyten adhesie en migratie. Twee complementaire strategieën zijn gebruikt voor dit doel: intravitale microscopie (IVM) en homing experimenten. Hoewel de IVM is essentieel om de precieze bijdrage van specifieke adhesie receptoren tijdens de hechting cascade in real time en in verschillende weefsels te definiëren, IVM is tijdrovend en arbeidsintensief, vaak de ontwikkeling van geavanceerde chirurgische technieken vereist, moet het voorafgaande scheiding van homogene celpopulaties en het mogelijk maakt de analyse van slechts een weefsel / orgaan op een bepaald moment. Daarentegen, concurrerende homing experimenten laat de directe en gelijktijdige vergelijking in de migratie van twee (of zelfs meer) cel subsets in dezelfde muis en ze ook toestaan ​​dat de analyse van een groot aantal weefsels en van een groot aantal cellen in hetzelfde experiment.

Hier beschrijven we de klassieke concurrerende homing protocol dat wordt gebruikt in het voordeel / nadeel van een bepaald celtype te bepalen naar huis om specifieke weefsels in vergelijking met een controle-celpopulatie. We hebben ervoor gekozen om de trekkende eigenschappen van darm-tropische versus niet gut-tropische T-cellen te illustreren, omdat het darmslijmvlies is de grootste lichaamsoppervlak in contact met de externe omgeving en het is ook de extra-lymfoïde weefsel met de beste gedefinieerde trekkende eisen . Bovendien heeft recent werk vastgesteld dat de vitamine A metaboliet all-trans retinoïnezuur (RA) is de belangrijkste moleculaire mechanisme dat verantwoordelijk is voor het induceren van darm-specifieke aanhechting receptoren (integrine a4b7and chemokine-receptor CCR9) op lymfocyten. Zo kunnen we snel grote aantallen van darm-tropische als niet-tropische darm lymfocyten ex vivo door het activeren van T-cellen in de aanwezigheid of afwezigheid van RA, respectievelijk, die uiteindelijk kan worden gebruikt in de concurrerende homing experimenten hier beschreven.

Protocol

1. Ex vivo generatie van darm-homing en controle op T-cellen (zie figuur 1)

  1. Isoleer splenocyten door stampen een milt van wild-type muizen. Resuspendeer de cellen suspensie in PBS en centrifugeer gedurende 5 'op 400 x g. Verwijder het supernatant en lyseren van de rode bloedcellen door resuspenderen de cel pellet in 4 ml van ACK lysis buffer voor 2-3 minuten. Daarna, voeg 5 ml PBS. Centrifugeer gedurende 5 'op 400 xg en verwijder het supernatant.
  2. Resuspendeer totaal splenocyten op 1 x 10 6 / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-mercapto-ethanol + penicilline / streptomycine (compleet IMDM). Scheid de cellen in twee groepen, waarvan er een is met RA (of synthetische RAR-agonisten, zoals Am80 of Am580), aangevuld tot een uiteindelijke concentratie van 100-200 nM 3. T-cellen geactiveerd in de aanwezigheid van een RA-of RAR-agonisten zullen upregulate a4b7and CCR9 en zal gut-tropische T-cellen, terwijl T-cellen geactiveerd zonder RA zal controle T-cellen.
  3. Voeg 1,5-2,0 ml van de celsuspensie in elk putje van een 24-wells plaat voorheen bekleed met anti-CD3 (10 mg / ml) en anti-CD28 (10 mg / ml) toe en incubeer bij 37 ° C in 5% CO 2 (voor het coaten van de plaat toe te voegen 500 ml / putje van anti-CD3 plus anti-CD28 in PBS en incubeer gedurende 2 uur bij 37 ˚ C en vervolgens twee keer wassen met 2 ml PBS).
  4. Om de T-cel overstimulatie te vermijden, overdragen na 2-3 dagen de cel suspensies in een nieuwe ongestreken 24-well plaat. Incubeer extra 2-3 dagen. Afhankelijk van de celdichtheid en proliferatie in de media zou kunnen worden zuur (geel), in welk geval kan het noodzakelijk zijn om de helft van de media te vervangen door verse volledig IMDM. Oogst de cellen na 4-5 dagen (te rekenen vanaf dag 0).
  5. Typische uiteindelijke opbrengsten zijn 1-2 x 10 6 effector-T-cellen / well. Daarom moet een minimum van 9-12 putten van elk darm-tropische T-cellen en T-cellen controle worden uitgeplaat in om te eindigen met 10-20 x 10 6 T-cellen per conditie.

2. Analyse van de darm-homing receptoren op de geactiveerde T-cellen

Na 4-5 dagen van de cultuur die we moeten houden aan een hoge expressie van darm-homing receptoren a4b7and CCR9 op T-cellen geactiveerd in de aanwezigheid van een RA-of RAR-agonisten, terwijl controle T-cellen moeten verwoorden zeer lage niveaus van deze receptoren 4.

Flowcytometrie (FACS) analyse.

  1. Verzamel tussen 0,2-0,5 x10 6 cellen en centrifugeer 5 minuten bij 300 g bij 4 ° C.
  2. Incubeer met anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) en anti-CD8-PercP gedurende 15 min bij 4 ° C in het donker.
  3. Na de incubatie, centrifuge gedurende 5 minuten bij 300 g 4 ° C. Wassen en de cellen resuspendeer in kleuren buffer en analyseren door FACS.

3. T-cel etikettering met CFSE en CMTMR cel trackers

  1. Houd alle oplossingen bij 37 ° C alvorens te beginnen. Was gut-tropische T-cellen (a4b7 High CCR9 Hoog) en controle op T-cellen (a4b7 Low / Neg CCR9 Low / Neg) tweemaal met PBS om het serum te verwijderen. Pas de T-cel-concentratie tot 10-15 x 10 6 / ml in PBS.
  2. Voeg CFSE (carboxyfluoresceïne succinimidylester) of CMTMR (chloormethyl-benzoyl-amino-tetramethylrodamine) fluoroforen ofwel gut-tropische T en controle T-cellen tot een uiteindelijke concentratie van 5 mm en 10 mm, respectievelijk, zacht vortex en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 ° C. Het wordt aanbevolen om de labelings swap in dezelfde of in een afzonderlijk experiment om potentiële intrinsieke effecten van fluoroforen op de T-cel migratie uit te sluiten.
  3. Na de incubatie, blussen met een volume van FBS en incubeer voor 1-5 min bij kamertemperatuur. Verdun 10 keer met warm PBS en centrifugeer 5 minuten bij 300 g. Was tweemaal met PBS en resuspendeer in complete IMDM.
  4. Idealiter zou 10 tot 20 x 10 6 cellen van elk T bevolking worden gemengd in een 1:1 verhouding en vervolgens gecentrifugeerd bij 300 xg gedurende 5 minuten. Ten slotte is resuspendeer de cellen in 200-250 ml van de warme PBS en injecteren via de staartader.
  5. Voor het berekenen van de exacte ingang ratio (ideale ligging dicht bij 1) op te slaan 5-10 ml van de geïnjecteerde celsuspensie en verdun met 300 ml PBS en analyseren door FACS.

4. Analyse van de T-cel homing

Hoewel muizen kunnen worden geanalyseerd op verschillende tijdstippen (tussen 1 uur en enkele dagen na de T-cel-injectie), is homing van darm-tropische T-cellen best gedocumenteerde tussen de 12-24 uur na de injectie. Langere tijd punten te verhogen van de potentiële effecten van andere variabelen die de laatste cel aantallen / verhoudingen, zoals T-cel apoptose en T-cel af te sluiten uit het weefsel. Nadat de muizen zijn gedood, celsuspensies van verschillende weefsels moeten worden geïsoleerd zonder uitstel om celdood verlagen, kan dat invloed op de uiteindelijke opbrengsten en resultaten. Weefsels van belang zijn de dunne darm, dikke darm, milt, lymfeklieren, plaques van Peyer, lever, longen en bloed. Als hetgeïnjecteerd T-cellen zijn bona fide gut-tropische T-cellen, moeten zij thuis gemiddeld 5-10 keer beter (of hoger) naar de dunne darm slijmvlies in vergelijking met de T-cellen te controleren. Moet echter andere weefsels, zoals bloed en de milt, niet vertonen een preferentieel T-cel migratie. Isolatie van lymfocyten uit de darm lamina propria en de intra-epitheliale compartiment is eerder beschreven 5.

  1. FACS kleuring: De monsters worden geresuspendeerd, afhankelijk van het aantal cellen verzameld, met een dichtheid niet hoger dan 3,0 x 10 6 cellen / ml. Als congenic CD45.1 + of Thy1.1 + muizen werden gebruikt als ontvangers, worden de cellen gekleurd met de bijbehorende congenic marker (bijv. CD45.2 of Thy1.2) in combinatie met een aantal afstamming marker (bijv. TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +).
  2. Tijdens de FACS-analyse, cellen gated op de congenic marker (bijv. CD45.1) en vervolgens op de specifieke lijn markers (bijv. CD4/CD8) en geanalyseerd op de verhouding tussen CMTMR en CFSE positieve cellen.
  3. De gegevens worden gewoonlijk uitgedrukt als de Homing Index (HI), die wordt berekend als de verhouding CFSE / CMTMR (of CMTMR / CFSE) in elk weefsel, gedeeld door de corresponderende ingang ratio (zie hieronder). Als de input-verhouding is zeer dicht bij 1, dan is het weefsel ratio's zullen gelijk zijn aan de HI.

HI = CFSE weefsel / CMTMR weefsel: CFSE input / CMTMR ingang

Bloed moet ook worden geanalyseerd om te bepalen of beide T-celpopulaties gelijk vertegenwoordigd zijn in de circulatie, of als een T-cel populatie wordt verlaagd respect naar de andere (bijvoorbeeld door preferentiële vangen in de longen / lever of door een verminderde levensvatbaarheid). Dit kan gebeuren bij het vergelijken naïef of rusten geheugen T-cellen ten opzichte van recentelijk geactiveerde effector-T-cellen, aangezien dit kan worden afgevangen om een ​​grotere mate in de longen. Als de HI in het bloed is significant anders is dan 1, kan een HI normaliseren in de weefsels door de HI in het bloed. Bloed kan worden verkregen via het hart doorboren van muizen verdoofd (met Avertin of isofluorane voor euthanasie) en moet twee keer worden gelyseerd met ACK buffer voordat u deze voor FACS kleuring.

Bloed normaliseren = HI weefsel / HI Blood

5. Representatieve resultaten

Ontvangende muizen (Thy1.1 +) waren euthanized18h na de cel injectie. Celsuspensies werden gegenereerd uit de milt, perifere lymfeklieren (PLN), mesenteriale lymfeklieren (MLN) en de dunne darm lamina Propia (LP). Na dat de cellen werden gekleurd voor Thy1.2 en CD8 en vervolgens geanalyseerd door FACS door gating op levensvatbare Thy1.2 + CD8 + cellen, die uiteindelijk werden geanalyseerd op de verhouding tussen CMTMR + cellen (darm-tropische T-cellen) en de CFSE + cellen (controle T-cellen) gedeeld door de input-ratio. De resultaten kunnen worden weergegeven zoals in figuur 2, waarin het kan worden begrepen dat gut-tropische en controle T-cellen homed ook voor de milt (HI dicht tot1, aangegeven met een rode lijn). Daarentegen, gut-tropische T-cellen migreerden ongeveer 10 keer efficiënter naar de LP in vergelijking met de T-cellen te controleren.

Figuur 1
Figuur 1:. Diagram van de generatie en de etikettering van darm-tropische en niet-gut tropische T-cellen T-cellen worden geïsoleerd van wild-type muizen en geactiveerd met anti-CD3/anti-CD28 en in de aanwezigheid of afwezigheid van 100-200 nM alle - trans retinoïnezuur (RA). Na 4-5 dagen RA behandeld met T-cel het verwerven van de expressie van de darm homing receptoren CCR9 en a4b7. Vervolgens worden gut-tropische en controle T-cellen verschillend gelabeld met CFSE of CMTMR, gewassen, gemengd in een verhouding van 1:1 en geïnjecteerd in een ontvanger muis via de staartader. Een aantal gelabelde cellen worden gebruikt om de CFSE / CMTMR ingang ratio (moet dicht bij 1 worden) te bepalen.

Figuur 2
Figuur 2:. Voorbeeld van een homing analyse Muizen geanalyseerd 12-18 uur na de T-cel-injectie en single celsuspensies worden verkregen uit de organen van belang. De cellen zijn gekleurd met anti-Thy1.2 (congenic marker) plus anti-CD8 en dan Thy1.2 + CD8 + T-cellen worden geanalyseerd op de verhouding van CMTMR + en CFSE + cellen in elk weefsel door FACS. Het weefsel CMTMR / CFSE ratio's worden vervolgens genormaliseerd door de Input CMTMR / CFSE verhouding tot de homing indices (HI) te verkrijgen. In dit voorbeeld CMTMR + en CFSE + cellen zijn darm-tropische en controle effector T-cellen, respectievelijk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel homing experimenten zorgen voor een zeer waardevolle informatie over de migratie van het totaal celpopulaties in een bepaald weefsel, moet in gedachten worden gehouden dat deze testen niet rechtstreeks endotheel hechting daarom te analyseren en niet discrimineren, waarin stap (pen) van de meerstaps hechting cascade (tethering / rollen, activering of plakken) een bepaalde homing receptor optreedt. De gouden standaard om de specifieke rol van de homing-receptoren te definiëren in de hechting cascade is intravitale microscopie (IVM), waarin individuele fluorescent gelabelde T-cellen (of andere cellen of zelfs fluorescent gelabelde kralen) rechtstreeks worden waargenomen interactie met endotheliale cellen in real time. Echter, IVM is tijdrovend, vergt muis verdoving, impliceert moeizame chirurgische procedures en behoeften voorafgaande isolatie van groot aantal zuivere en homogene cel populaties voor de etikettering en de injectie. Bovendien zijn sommige weefsels, zoals het centrale zenuwstelsel (CZS) en de thymus, zijn moeilijk toegankelijk voor de IVM. Tot slot, IVM de voorbereidingen vereisen weefsel immobilisatie die moeilijk te bereiken in een aantal organen / weefsels, zoals lever, longen en darmen (voor een gedetailleerde bespreking van IVM zie ref. 6).

Aan de andere kant, homing experimenten zijn relatief eenvoudig op te zetten, kunnen ze competitief worden gedaan door co-injectie van twee differentieel gelabeld T-celpopulaties, en ze laten de gelijktijdige controle van meerdere weefsels / organen en celpopulaties in een enkel experiment door FACS . In een competitieve homing experiment is het de bedoeling om te bepalen wat de relatieve migratie van een T-cel populatie opzichte van een ander (differentieel label) T-cel populatie in verschillende weefsels. Omdat de resultaten worden uitgedrukt als HI, doe de analyses geen absolute cel-tellingen en de resultaten worden niet beïnvloed door het aantal geïnjecteerde T-cellen, door het aantal geïsoleerde / geanalyseerd T-cellen in elk weefsel of door eventuele verschillen in de dieren / organen grootte.

Ondanks deze voordelen, dient te worden gehouden met het feit dat concurrerende homing experimenten geen informatie over de daadwerkelijke omvang van T-cel-migratie in elk weefsel te bieden. In feite, HI kan zeer misleidend zijn in weefsels met een zeer slechte T-cel migratie en van waaruit heel weinig T-cellen kan worden gedetecteerd door FACS, zoals in de niet-ontstoken dikke darm of het CNS (paar T-cel gebeurtenissen die besmet bloed zouden kunnen betekenen kan resulteren in enorme variaties in HI). Als algemene regel geldt dat HI alleen worden gebruikt als er voldoende aantallen gebeurtenissen worden gedetecteerd door FACS, zodat ten minste een van de gelabelde T-cel populaties kan duidelijk worden geïdentificeerd in een bepaald weefsel.

Ten slotte moet concurrerend homing experimenten en berekeningen HI idealiter worden aangevuld met absolute cel-telling van T-cellen (meestal uitgedrukt als het aantal T-cellen in een weefsel per 1 x 10 6 in totaal geïnjecteerd T-cellen). Echter, het bepalen van absolute aantallen T-cellen in elk weefsel is tijdrovend en de betrouwbaarheid / reproduceerbaarheid is afhankelijk van een zorgvuldige injectietechniek om te verzekeren dat de meeste T-cellen zijn intraveneus en op een efficiënte T-cel los van elkaar weefsel geïnjecteerd.

Samengevat hebben we beschreven concurrerende homing experimenten tussen darm-tropische en controle T-cellen. Toch kan deze methode worden toegepast op vele andere lymfoïde cellen (bijvoorbeeld, naïef of geactiveerde T-en B-cellen, T REG, enz.) en ook voor niet-lymfoïde cellen (bijvoorbeeld, DC, stamcellen, etc.). Zo homing experimenten bieden een eenvoudige, veelzijdige en krachtige tool om celmigratie in-vivo studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

EJV wordt ondersteund door een beurs van de Crohn en Colitis Ulcerosa s Foundation of America (CCFA). JRM wordt ondersteund door subsidies van CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) en New Innovator NIH directeur s Award.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.
ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).
PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).
Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.
T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.
Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.
Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).
All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
  2. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
  3. Iwata, M. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21, 527-538 (2004).
  4. Mora, J. R. Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues. J Exp Med. 201, 303-316 (2005).
  5. Mora, J. R. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells. Nature. 424, 88-93 (2003).
  6. Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).

Tags

Immunologie Homing competitieve gut-tropisme chemokine in vivo
Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villablanca, E. J., Mora, J. R.More

Villablanca, E. J., Mora, J. R. Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration. J. Vis. Exp. (49), e2619, doi:10.3791/2619 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter