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Immunology and Infection

Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T

Published: March 1, 2011 doi: 10.3791/2619

Summary

Esperimenti di homing competitivo permettono di valutare direttamente le proprietà migratorie di due diverse popolazioni cellulari in un mouse. Qui illustrare questa procedura confrontando la migrazione di ex vivo generata gut-tropico rispetto a non-intestinali cellule T tropico.

Abstract

Al fine di esercitare la loro funzione di linfociti bisogno di lasciare il sangue e migrare in vari tessuti del corpo. Adesione dei linfociti alle cellule endoteliali e lo stravaso del tessuto è un processo a più fasi controllate da molecole di adesione diversi (recettori di homing) ha espresso sui linfociti e le loro rispettive ligandi (addressins) visualizzati sulle cellule endoteliali 1 2. Anche se la funzione di questi recettori di adesione può essere parzialmente studiati ex vivo, l'esame finale per la loro rilevanza fisiologica è quello di valutare il loro ruolo in vivo durante l'adesione e la migrazione dei linfociti. Due strategie complementari sono state utilizzate per questo scopo: microscopia intravitale (IVM) e gli esperimenti di homing. Anche se IVM è stato essenziale per definire il contributo preciso di recettori di adesione specifici durante la cascata adesione in tempo reale e in diversi tessuti, IVM richiede tempo e lavoro intensivo, spesso richiede lo sviluppo di sofisticate tecniche chirurgiche, ha bisogno di isolamento prima di omogenea popolazioni di cellule e permette l'analisi di un solo tessuto / organo in un dato momento. Al contrario, competitivo esperimenti di homing consentono il confronto diretto e simultaneo nella migrazione di due (o più) sottoinsiemi cellula lo stesso mouse e permettono anche l'analisi di molti tessuti e di un elevato numero di cellule nel medesimo esperimento.

Qui si descrive il classico protocollo di homing competitivo utilizzato per determinare il vantaggio / svantaggio di un tipo di cellula dato casa ai tessuti specifici rispetto ad una popolazione di cellule di controllo. Abbiamo scelto di illustrare le proprietà migratorie di gut-tropico rispetto a non gut-tropico cellule T, perché la mucosa intestinale è la superficie più grande corpo a contatto con l'ambiente esterno ed è anche l'olio extra-tessuto linfoide con il meglio definiti i requisiti migratori . Inoltre, un recente lavoro ha stabilito che la vitamina A metabolita acido all-trans retinoico (RA) è il principale meccanismo molecolare responsabile per indurre gut-specifici recettori di adesione (integrine recettori delle chemochine a4b7and CCR9) sui linfociti. Quindi, possiamo facilmente generare un gran numero di gut-tropico e non gut-tropico linfociti ex vivo, attivando le cellule T, in presenza o assenza di RA, rispettivamente, che possono essere finalmente utilizzati negli esperimenti di homing competitivo qui descritto.

Protocol

1. Generazione ex vivo di cellule T gut-homing e di controllo (vedi Figura 1)

  1. Isolare splenociti da schiacciare uno milza di topi wild-type. Risospendere la sospensione le cellule in PBS e centrifugare per 5 'a 400 x g. Rimuovere il supernatante e lisare i globuli rossi da risospendere il pellet in 4 ml di tampone di lisi ACK per 2-3 minuti. Dopo di che, aggiungere 5 ml di PBS. Centrifugare per 5 'a 400 xg ed eliminare il surnatante.
  2. Risospendere splenociti totale a 1 x 10 6 / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM di 2-mercaptoetanolo + penicillina / streptomicina (IMDM completo). Separare le cellule in due gruppi, uno dei quali è integrato con AR (o sintetiche RAR-agonisti, come Am80 o Am580) ad una concentrazione finale di 100-200 nM 3. Cellule T attivate in presenza di RA o RAR-agonisti sarà upregulate a4b7and CCR9 e diventerà gut-tropico cellule T, mentre le cellule T attivate senza RA diventeranno cellule T di controllo.
  3. Aggiungere 1,5-2,0 mL di sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una 24-pozzetti precedentemente rivestita con anti-CD3 (10 mg / ml) e anti-CD28 (10 mg / ml) e incubare a 37 ° C in 5% di CO 2 (per il rivestimento della piastra aggiungere 500 ml / pozzetto di anti-CD3, più anti-CD28 in PBS e incubare per 2 ore a 37 ˚ C e poi lavare due volte con 2 ml di PBS).
  4. Al fine di evitare eccesso di stimolazione delle cellule T, dopo 2-3 giorni il trasferimento delle sospensioni di cellule in una nuova patinata 24-pozzetti. Incubare per altri 2-3 giorni. A seconda della densità delle cellule e la proliferazione dei media potrebbe diventare acido (giallo), nel qual caso potrebbe essere necessario sostituire la metà della media con fresca IMDM completa. Raccogliere le cellule dopo 4-5 giorni (contando da giorno 0).
  5. Tipici rendimenti finali sono 1-2 x 10 6 cellule T effettrici / bene. Quindi, un minimo di 9-12 pozzi di ogni gut-tropico cellule T ed il controllo delle cellule T dovrebbe essere placcato per finire con 10-20 x 10 6 cellule T per condizione.

2. Analisi di gut-homing recettori su cellule T attivate

Dopo 4-5 giorni di coltura si dovrebbero osservare un'alta espressione di gut-homing a4b7and CCR9 recettori sulle cellule T attivate in presenza di agonisti RA o RAR, mentre il controllo delle cellule T dovrebbe esprimere livelli molto bassi di questi recettori 4.

Citometria a flusso (FACS) analisi.

  1. Raccogliere tra 0,2-0,5 x10 6 celle e centrifugare per 5 min a 300 g a 4 ° C.
  2. Incubare con anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) e anti-CD8-PerCP per 15 minuti a 4 ° C al buio.
  3. Dopo l'incubazione, centrifugare per 5 min a 300 g 4 ° C. Lavare e risospendere le cellule in colorazione buffer e analizzare con il FACS.

3. T etichettatura cella con inseguitori cellula CFSE e CMTMR

  1. Tenere tutte le soluzioni a 37 ° C prima di iniziare. Lavare gut-tropico cellule T (a4b7 alta CCR9 alta) e il controllo delle cellule T (a4b7 Basso / Neg CCR9 Basso / Neg) due volte con PBS per rimuovere il siero. Regolare la concentrazione delle cellule T a 10-15 x 10 6 / ml in PBS.
  2. Aggiungi CFSE (Carboxyfluorescein succinimidile estere) o CMTMR (clorometil-benzoil-amino-tetrametilrodamina) fluorofori a uno gut-tropico T e il controllo delle cellule T ad una concentrazione finale di 5 mm e 10 mm, rispettivamente, dolcemente vortex e incubare per 20 minuti a 37 ° C. Si raccomanda di scambiare le labelings nello stesso o in un esperimento separato per escludere potenziali effetti intrinseci di fluorofori sulla migrazione delle cellule T.
  3. Dopo l'incubazione, spegnere con 1 volume di FBS e incubare per 1-5 minuti a temperatura ambiente. Diluire 10 volte con caldo PBS e centrifugare per 5 min a 300 g. Lavare due volte con PBS e risospendere in IMDM completo.
  4. Idealmente, 10-20 x 10 6 cellule di ogni popolazione T deve essere miscelato in rapporto 1:1 e poi centrifugato a 300 xg per 5 min. Infine, risospendere le cellule in 200-250 ml di PBS caldo e iniettare attraverso la vena della coda.
  5. Per calcolare il rapporto esatto di ingresso (idealmente prossimo a 1) salvare 5-10 ml di sospensione cellulare iniettato e diluire con 300 ml di PBS e analizzare con il FACS.

4. Analisi di homing delle cellule T

Anche se i topi possono essere analizzati in vari momenti (tra 1 ora e diversi giorni dopo l'iniezione di cellule T), homing di gut-tropico cellule T è meglio documentato tra 12-24 ore dopo l'iniezione. Punti di tempo più lungo aumentare i potenziali effetti di altre variabili che incidono sulla cella finale numeri / rapporti, come ad esempio l'apoptosi delle cellule T e cellule T uscita dal tessuto. Dopo i topi sono eutanasia, sospensioni cellulari da tessuti diversi devono essere isolati senza indugio al fine di diminuire la morte delle cellule, che potrebbero influire sul rendimento finale e risultati. I tessuti di interesse sono il piccolo intestino, colon, milza, linfonodi, placche di Peyer, fegato, polmoni e sangue. Se l'iniettate cellule T sono in buona fede gut-tropico cellule T, che dovrebbero a casa in media 5-10 volte migliore (o superiore) alla mucosa dell'intestino tenue rispetto al controllo delle cellule T. Tuttavia, altri tessuti, come il sangue e la milza, non dovrebbe mostrare una preferenziale la migrazione delle cellule T. Isolamento dei linfociti da lamina propria intestinale e il vano intraepiteliale è stato descritto in precedenza 5.

  1. Colorazione FACS: I campioni sono risospesi a seconda del numero di cellule raccolte, con una densità non superiore a 3,0 x 10 6 cellule / ml. Se congenic CD45.1 + o + Thy1.1 topi sono stati usati come destinatari, le cellule sono colorate con il marcatore corrispondente congenic (ad esempio, CD45.2 o Thy1.2) in combinazione con alcuni marker lignaggio (ad esempio, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 + / CD45.2 +).
  2. Durante l'analisi FACS, le cellule sono gated sul marcatore congenic (ad esempio CD45.1) e poi sui globi lineage specifici (ad esempio CD4/CD8) e analizzati per i rapporti tra CMTMR e cellule CFSE positivo.
  3. I dati sono di solito espressa come l'Indice di Homing (HI), che è calcolato come rapporto CFSE / CMTMR (o CMTMR / CFSE) in ogni tessuto divisa per il rapporto di ingresso corrispondente (vedi sotto). Se il rapporto di ingresso è molto vicino a 1, poi i rapporti tessuto sarà equivalente al HI.

HI = CFSE tessuto / tessuto CMTMR: CFSE ingresso / CMTMR ingresso

Il sangue dovrebbe essere analizzati al fine di determinare se le due popolazioni di cellule T sono ugualmente rappresentati in circolazione o se una popolazione di cellule T è diminuito rispetto agli altri (ad esempio, intrappolando preferenziale nei polmoni / fegato o con vitalità ridotta). Ciò può accadere quando si confrontano ingenuo o di riposo delle cellule T memoria rispetto recentemente attivato le cellule T effettrici, in quanto quest'ultimo potrebbe essere intrappolato in misura maggiore nei polmoni. Se il HI nel sangue è significativamente diverso da 1, si può normalizzare HI nei tessuti dalla HI nel sangue. Sangue può essere ottenuto tramite puntura cardiaca di topi anestetizzati (con l'eutanasia o Avertin isofluorane precedente) e devono essere lisate due volte con tampone ACK prima di utilizzarlo per la colorazione FACS.

Normalizzazione sangue = HI tessuto / HI Sangue

5. Rappresentante Risultati

Topi riceventi (Thy1.1 +) sono stati dopo l'iniezione euthanized18h cellulare. Sospensioni cellulari sono stati generati dalla milza, linfonodi periferici (PLN), linfonodi mesenterici (MLN) e piccola lamina propia intestino (LP). Dopo che le cellule sono state colorate per Thy1.2 e CD8 e poi analizzati da FACS di gating su valida Thy1.2 + cellule CD8 +, che sono stati infine analizzati per il rapporto tra le cellule CMTMR + (gut-tropico cellule T) e CFSE + cellule (controllo di cellule T) divisa per il rapporto di ingresso. I risultati possono essere visualizzati come mostrato nella Figura 2, in cui può essere apprezzato che gut-tropico e il controllo delle cellule T homed anche per la milza (HI vicino a 1, indicato con una linea rossa). Al contrario, gut-tropico cellule T migrate circa 10 volte più efficiente al LP rispetto al controllo delle cellule T.

Figura 1
Figura 1:. Schema della generazione e l'etichettatura di gut-tropico e non-gut cellule T tropico cellule T sono isolate da topi wild-type e attivato con anti-CD3/anti-CD28 e in presenza o assenza di 100-200 nM tutti - trans retinoico (RA). Dopo 4-5 giorni AR trattati con cellule T acquisire l'espressione dei recettori di homing intestino CCR9 e a4b7. Poi, gut-tropico e il controllo delle cellule T sono etichettati in modo differenziale con CFSE o CMTMR, lavati, mescolati in rapporto 1:1 e iniettato in un topo destinatario attraverso la vena della coda. Alcune cellule marcate sono utilizzati per determinare il CFSE / CMTMR rapporto input (dovrebbe essere vicino a 1).

Figura 2
Figura 2:. Esempio di analisi homing topi analizzati 12-18 ore dopo l'iniezione di cellule T e le sospensioni singola cella sono ottenute dagli organi di interesse. Le cellule sono colorate con anti-Thy1.2 (marcatore congenic) più anti-CD8 + e poi Thy1.2 cellule T CD8 + vengono analizzati per il rapporto tra CMTMR CFSE + + e le cellule di ogni tessuto da FACS. Il CMTMR / CFSE rapporti tessuti vengono poi normalizzate dal rapporto input CMTMR / CFSE di ottenere gli indici di homing (HI). In questo esempio e + CMTMR CFSE cellule + sono gut-tropico e le cellule T effettrici controllo, rispettivamente.

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Discussion

Anche se gli esperimenti di homing fornire informazioni molto importanti sulla migrazione di popolazioni di cellule totali in qualsiasi tessuto dato, va tenuto presente che questi test non direttamente analizzare l'adesione endoteliale e, pertanto, che non discriminino in cui passo (s) del adesione multistep cascata (tethering / a rotazione, l'attivazione o attaccare), un recettore dato homing agisce. Il gold standard per definire il ruolo specifico dei recettori di homing in cascata l'adesione è microscopia intravitale (IVM) in cui le singole cellule fluorescente T (o altre cellule o perle anche fluorescente) sono osservati direttamente interagiscono con le cellule endoteliali in tempo reale. Tuttavia, IVM richiede tempo, richiede l'anestesia del mouse, comporta laboriose procedure chirurgiche e le necessità di isolamento prima di un gran numero di popolazioni di cellule pure e omogenee per l'etichettatura e l'iniezione. Inoltre, alcuni tessuti, come il sistema nervoso centrale (SNC) e il timo, sono di difficile accesso per IVM. Infine, i preparativi IVM richiedono immobilizzazione tessuto che è difficile da raggiungere in alcuni organi / tessuti, come fegato, polmoni e intestino (per una discussione dettagliata sulla IVM vedi rif. 6).

D'altra parte, gli esperimenti di homing sono relativamente facili da configurare, essi possono essere effettuati competitivo dal co-iniezione di due popolazioni di cellule T etichettati in modo differenziato, e consentono l'esame simultaneo di diversi tessuti / organi e popolazioni di cellule in un singolo esperimento di FACS . In un esperimento di homing competitivo l'obiettivo è quello di determinare quale sia la migrazione relativa di una popolazione di cellule T rispetto ad un altro (etichettato in modo differenziato) popolazione di cellule T in diversi tessuti. Poiché i risultati sono espressi come HI, le analisi non hanno bisogno di conta delle cellule assoluto ed i risultati non sono influenzati dal numero di iniettate cellule T, per il numero di isolati / analizzato le cellule T in tutti i tessuti e da eventuali differenze di animali / organi dimensioni.

Nonostante questi vantaggi, va tenuto presente che gli esperimenti di homing competitivo non forniscono informazioni circa l'entità effettiva della migrazione delle cellule T in tutti i tessuti. In realtà, HI può essere molto fuorviante nei tessuti con molto poveri migrazione delle cellule T e da cui le cellule T pochissimi può essere rilevato da FACS, come ad esempio nel settore non-infiammato colon o del SNC (pochi eventi di cellule T che potrebbe rappresentare la contaminazione del sangue può portare a enormi variazioni in HI). Come regola generale, HI dovrebbe essere utilizzato solo quando un numero sufficiente di eventi vengono rilevati da FACS, in modo che almeno una delle popolazioni di cellule T etichetta può essere chiaramente identificati in un dato tessuto.

Infine, esperimenti di homing competitivo e calcoli HI dovrebbe essere idealmente completato con cella di conteggio assoluto delle cellule T (di solito espressa come il numero di cellule T in un tessuto per 1 x 10 6 cellule iniettate totale T). Tuttavia, la fissazione del numero assoluto di cellule T in ogni tessuto richiede molto tempo e la sua affidabilità / riproducibilità dipenderà da un'attenta tecnica di iniezione per assicurare che la maggior parte delle cellule T vengono iniettati per via endovenosa e efficiente isolamento delle cellule T da ogni tessuto.

In sintesi, abbiamo descritto gli esperimenti di homing competitivo tra gut-tropico e le cellule T di controllo. Tuttavia, questo metodo può essere applicato a molte altre cellule linfoidi (ad esempio, T naive o attivati ​​e le cellule B, T REG, ecc) e anche ai non-cellule linfoidi (ad esempio, DC, cellule staminali, ecc.) Così, gli esperimenti di homing di fornire uno strumento semplice, versatile e potente per studiare la migrazione delle cellule in vivo.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

EJV è sostenuto da una borsa di studio L's & colite di Crohn Foundation of America (CCFA). JRM è supportato anche da finanziamenti CCFA, Cancer Research Institute (CRI), Howard H. Goodman (MGH), Massachusetts Life Science Center (MLSC) e Innovator Award nuovo direttore del NIH s.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).
Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.
ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).
PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).
Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.
T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.
Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.
Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).
All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).

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References

  1. Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
  2. Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
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  5. Mora, J. R. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells. Nature. 424, 88-93 (2003).
  6. Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).

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Immunologia Numero 49 Homing competitivo gut-tropismo chemochine in vivo
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Villablanca, E. J., Mora, J. R.More

Villablanca, E. J., Mora, J. R. Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration. J. Vis. Exp. (49), e2619, doi:10.3791/2619 (2011).

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