Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

Summary

Rekabetçi homing deneyler, doğrudan tek bir fare iki farklı hücre popülasyonlarının göçmen özelliklerinin değerlendirilmesi için izin verir. Burada oluşturulan ex vivo gut-tropik karşı-gut olmayan tropik T hücreleri göç karşılaştırarak bu yordamı göstermektedir.

Abstract

Altına almak üzere fonksiyon lenfositler, kan terk ve vücudun farklı dokulara göç etmek gerekir. Endotel hücreleri ve doku ekstravazasyonu Lenfosit yapışır lenfositler ve endotel hücreleri ^{1 2} görüntülenen kendi ligandlar (addressins) ifade farklı adezyon molekülleri tarafından kontrol edilen çok adımlı bir süreç (homing reseptörler). Bu adezyon reseptörlerinin fonksiyon kısmen çalışılan rağmen ex vivo, in vivo lenfosit yapışma ve göç sırasında fizyolojik alaka için nihai test rollerini değerlendirmek için. Intravital mikroskobu (IVM) ve homing deneyler: İki tamamlayıcı stratejiler, bu amaç için kullanılır olmuştur. IVM yapışma kaskad sırasında gerçek zamanlı olarak ve farklı dokularda spesifik adezyon reseptörleri kesin katkısını tanımlamak için gerekli olmasına rağmen, IVM, yoğun zaman alıcı ve emek, genellikle gelişmiş cerrahi tekniklerin geliştirilmesini gerektirir, homojen önceden izolasyon ihtiyacı hücre popülasyonlarının ve herhangi bir zamanda sadece bir doku / organ analizine izin verir. Buna karşılık, rekabetçi homing deneyler aynı fare göç iki (hatta daha fazla) hücre alt direkt ve eş zamanlı karşılaştırma izin verir ve onlar da birçok dokuların ve hücrelerin aynı deneyi bir yüksek sayıda analiz izin.

Burada bir kontrol hücre popülasyonu ile karşılaştırıldığında belirli dokulara belirli bir hücre tipi avantajı / dezavantajı belirlemek için kullanılan klasik rekabetçi homing protokol açıklar. Bağırsak mukozasının dış çevre ile temas halinde büyük vücut yüzey, çünkü, gut-tropik karşı gut-tropik olmayan T hücreleri göçmen özelliklerini göstermek için seçti ve aynı zamanda iyi tanımlanmış göçmen gereksinimleri ile ekstra-lenfoid doku . Ayrıca son çalışma, vitamin A metabolit all-trans retinoik asit (RA) lenfositler gut-spesifik adezyon reseptörleri (integrin a4b7and kemokin reseptör CCR9) uyarılacak sorumlu başlıca moleküler mekanizma olduğunu belirlemiştir. Bu yüzden, kolayca sonunda, burada açıklanan rekabetçi homing deneylerde kullanılabilecek, sırasıyla, RA varlığı ya da yokluğu T hücreleri aktive ederek, gut-tropik ve lenfositler gut-tropik olmayan ex vivo çok sayıda üretebilirsiniz.

Protocol

1. gut-homing ve kontrol T hücrelerinin ex vivo nesil (bkz. Şekil 1)

1. Vahşi tip farelerin dalak bir ezme splenositlerin izole edin. 5 '400 x g. hücreler PBS içinde süspansiyon ve santrifüj yeniden süspanse Süpernatantı ve kırmızı kan hücreleri, 2-3 dakika için ACK lizis tamponu 4 ml hücre pelletini resuspending lyse. Bundan sonra, 5 ml PBS ekleyin. 400 xg'de 5 'Santrifüj ve supernatant çıkarın.
2. 1 toplam splenositlerin süspanse edin x 10 ⁶ / mL IMDM +% 10 FBS + 50 mM 2-merkaptoetanol + penisilin / streptomisin (tam IMDM). RA (ya da, Am80 ya da Am580 olarak sentetik RAR-agonistleri) 100-200 ^nM 3 final konsantrasyon ile desteklenmiş bir tanesi iki grup, hücrelerin ayırın . RA varlığı veya RAR-agonistler aktive T hücreleri a4b7and CCR9 upregüle ve RA olmaksızın aktive T hücreleri, T hücreleri kontrol olacak iken, gut-tropik T hücreleri haline gelecektir.
3. 1.5-2.0 ml hücre süspansiyonu her bir kuyu için önceden anti-CD3 (10 mg / ml) ve anti-CD28 (10 mg / ml) ile kaplı bir 24 plaka ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO ₂ (plaka kaplama için 500 ml / anti-CD3 artı 37 az 2 saat, PBS ve inkübe anti-CD28 eklemek ° C ve daha sonra iki kez 2 ml PBS ile yıkama ).
4. T hücre aşırı uyarılma önlemek için, 2-3 gün sonra, yeni bir kaplanmamış 24 plaka içine hücre süspansiyonları transfer. Ek 2-3 gün inkübe edin. Hücre yoğunluğu ve çoğalması bağlı medya taze tam IMDM medyanın yarısını değiştirmek için gerekli olabilir, bu durumda asit (sarı), haline gelebilir. 4-5 gün sonra (gün 0 sayılarak) hücrelerinin Hasat.
5. Tipik nihai verim x 10 ⁶ efektör T hücreleri / iyi 1-2. Bu nedenle, her gut-tropik T hücreleri ve kontrol T hücreleri 9-12 kuyuların bir durum başına 10-20 x 10 ⁶ T hücreleri ile sonuna kadar en az kaplama olmalıdır .

2. Gut-homing reseptörleri aktive T hücreleri Analizi

Kültür 4-5 gün sonra biz kontrolü T hücreleri, bu ^{reseptörlere} 4 çok düşük düzeylerde ifade gerektiğinden, RA veya RAR agonistlerin varlığında aktive T hücreleri üzerindeki gut-homing reseptörleri a4b7and CCR9 yüksek bir ifade dikkat etmelisiniz .

Flow sitometri (FACS) analizi.

1. 300 gr az 5 dakika, 0.2-0.5 ^x10 6 hücre ve santrifüj arasında toplayın 4 ° C
2. 15 dakika 4 ° C karanlıkta için anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) ve anti-CD8-PercP ile inkübe edin.
3. Inkübasyondan sonra, g 4 ° C 300 5 dakika santrifüj Yıkayın ve tekrar süspansiyon hücreleri tampon boyama ve FACS tarafından analiz.

3. T hücre, KAKE ve CMTMR hücre izci ile etiketleme

1. 37 tüm çözümler tutun ° C başlamadan önce. PBS ile iki kez yıkayın gut-tropik T hücreleri ^(a4b7 Yüksek ^CCR9 Yüksek) ve kontrol T hücreleri ^{(a4b7 / Düşük} Neg ^{CCR9 / Düşük} Neg) serum kaldırmak için . T hücre konsantrasyonu 10-15 PBS içinde x 10 ⁶ / mL ayarlayın.
2. Yavaşça girdap ve 20 dakika boyunca inkübe, sırasıyla, 5 mM ve 10 mM nihai konsantrasyonu gut-tropik T ve kontrolü T hücreleri ya KAKE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) veya CMTMR (klorometil benzoil-amino-tetramethylrhodamine) fluorophores ekle 37 ° C T hücre göç fluorophores potansiyel intrensek etkileri ekarte etmek için, aynı ya da ayrı bir deneyde labelings takas etmek için tavsiye edilir.
3. Inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 1-5 dakika FBS ve inkübe 1 hacim ile soğutun. Sulandırınız sıcak PBS ile 10 kat ve 300 g az 5 dakika santrifüj PBS ile tekrar süspansiyon ile tam IMDM iki kez yıkayın.
4. İdeal olarak, her T nüfusunun 10-20 x 10 ⁶ hücre 1:1 oranında karıştırılır ve daha sonra 5 dakika süreyle 300 xg santrifüj edilmelidir . Son olarak, 200-250 ml sıcak PBS hücrelerin tekrar süspansiyon ve kuyruk damar yoluyla enjekte.
5. Tam giriş oranı (1 ideal yakın) hesaplamak için 5-10 ml enjekte edilen hücre süspansiyonu kaydetmek ve seyreltik ve 300 ml PBS ile FACS tarafından analiz.

4. Homing T hücre analizi

Fareler çeşitli zaman noktalarında (1 saat sonrası birkaç gün T hücre enjeksiyonu arasında) analiz edilebilmesine rağmen, gut-tropik T hücreleri sahipliği, 12-24 saat sonrası enjeksiyon arasında en iyi belgelenmiştir. Daha uzun zaman noktalarında numaraları / oranları, son hücre gibi T hücre apoptoz ve doku T hücre çıkış olarak etkileyen diğer değişkenlerin potansiyel etkilerini artırabilir. Fareler, hücre ölümünü azaltmak için çeşitli dokulardan ötenazi, hücre süspansiyonları gecikmeksizin izole edilmelidir sonra, nihai verim ve sonuçları etkileyebilir. Ilgi dokular ince bağırsak, kalın barsak, dalak, lenf düğümleri, Peyer Kullanıcı yamaları, karaciğer, akciğer ve kan vardır. Eğeriyi niyetli gut-tropik T hücreleri enjekte T hücreleri, T hücreleri kontrol etmek için karşılaştırıldığında, ince bağırsak mukoza için ortalama 5-10 kat daha iyi (veya üstü) eve gerekir. Ancak, kan ve dalak gibi diğer dokularda, tercihli bir T hücre migrasyonu göstermezler. Bağırsak lamina propria ve intraepitelyal bölmesi lenfositler İzolasyon, daha önce ⁵ tarif edilmiştir.

1. FACS boyama: Örnekler hücre sayısı 3.0 x 10 ⁶ hücre / ml 'den yüksek bir yoğunlukta, toplanan bağlı olarak yeniden süspanse. Eğer congenic CD45.1 ⁺ veya Thy1.1 ⁺ fareler alıcıları olarak kullanılan, hücrelerin bazı soy işaretleyici (örneğin, TCRbchain, CD4, CD8 ile birlikte ilgili congenic işaretleyici (örneğin, CD45.2 veya Thy1.2) ile boyandı. , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. FACS analizi sırasında, hücreler congenic marker (örneğin CD45.1) ve daha sonra belirli soy belirteçleri (örneğin CD4/CD8) kapılı ve CMTMR ve KAKE pozitif hücreler arasındaki oranların analiz.
3. Veriler genellikle ilgili giriş oranı (aşağıya bakın) bölünmesiyle her doku oranı KAKE / CMTMR (veya CMTMR / KAKE) olarak hesaplanan Homing Endeksi (HI), olarak ifade edilir. Giriş oranı 1 çok yakın ise, doku oranları HI eşdeğer olacaktır.

HI = KAKE _doku / CMTMR _doku: KAKE _giriş / CMTMR _girdi

Kan aynı zamanda her iki T hücre popülasyonlarının eşit dolaşımda temsil veya diğer ilgili (örneğin, akciğerlerin / karaciğer tercihli yakalama veya azalmış canlılığı ile) bir T hücre popülasyonunun azalmış ise olmadığını belirlemek için analiz edilmelidir. Ikincisi akciğerlerde büyük ölçüde sıkışıp olabilir bu yana, naif ya da dinlenme bellek T hücrelerine karşı son zamanlarda aktif efektör T hücreleri karşılaştırırken bu durum meydana gelebilir. Kan HI 1 den önemli ölçüde farklı ise, bir dokularda kan HI HI normalize. Kan anestezi farelerin kalp ponksiyon (AVERTIN veya isofluorane önce ötanazi ile) yoluyla elde edilebilir ve FACS boyama için ACK tampon kullanmadan önce iki kez parçalanmış olmalıdır.

Kan normalleşme = HI _doku / HI _Kan

5. Temsilcisi Sonuçlar

Alıcı fareler (Thy1.1 ⁺⁾ euthanized18h yazılan hücre enjeksiyonu. Hücre süspansiyonları, dalak, periferik lenf düğümleri (PLN), mezenterik lenf düğümleri (MLN) ve ince bağırsakta lamina propia (LP) oluşturulmuştur. Thy1.2 ve CD8 hücreleri lekeli ve sonra nihayet CMTMR ⁺ hücreleri (gut-tropik T hücreleri) ve KAKE arasındaki oranı analiz edildi yaşayabilir Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ hücreler, yolluk FACS tarafından analiz edildi Bundan sonra ⁺ giriş oranı ile bölünen hücrelerden (kontrol T hücreleri). Sonuçları Şekil 2, gut-tropik ve kontrol T hücreleri, dalak (HI, kırmızı bir çizgi ile gösterilir 1'e yakın) eşit girişli olduğu takdir edilebilir olduğu gösterildiği gibi gösterilebilir . Buna karşılık, gut-tropik T hücreleri, T hücreleri kontrol ile karşılaştırıldığında LP yaklaşık 10 kat daha verimli bir şekilde göç.

Şekil 1: Diyagram gut-tropik ve tropik T hücreleri-gut olmayan üretim ve etiketleme gösteren T hücreleri vahşi tip farelerden izole ve anti-CD3/anti-CD28 100-200 nM varlığı ya da yokluğu ile aktive edilir - trans retinoik asit (RA). 4-5 gün sonra RA-tedavi T hücre bağırsak homing reseptörleri CCR9 ve a4b7 ifade kazanır. Daha sonra, gut-tropik ve kontrol T hücreleri farklı bir 1:1 oranında karıştırılır ve bir alıcı fare kuyruğu damar yoluyla enjekte, yıkanmış, KAKE veya CMTMR etiketlenir. Bazı etiketli hücrelerin KAKE / CMTMR giriş oranı (1'e yakın olmalı) belirlemek için kullanılır.

Şekil 2: Örnek homing analiz Fare ilgi organları 12-18 saat sonrası T hücre enjeksiyonu ve tek hücre süspansiyonları elde edilen analiz etti. Hücreler, sonra da anti-Thy1.2 (congenic işaretleyici) artı anti-CD8 ve Thy1.2 ^{lekeli +} CD8 + T hücreleri CMTMR oranı analiz ve ^{KAKE +} + FACS tarafından her doku hücreleri . Sonra doku CMTMR / KAKE oranları homing indeksi (HI) elde etmek için Giriş CMTMR / KAKE oranına göre normalize edilir. Bu örnekte CMTMR ⁺ ve KAKE ⁺ hücrelerin sırasıyla gut-tropik ve kontrol efektör T hücreleri vardır.

Discussion

Homing deneyler herhangi bir doku toplam hücre popülasyonlarının göç hakkında çok değerli bilgiler sunmak olsa da, bu testlerin doğrudan endotel adezyonu analiz ve bu nedenle ayrımcılık akılda tutulması olmalıdır adımlı yapışma adım (lar) cascade (bağlama / haddeleme, aktivasyon veya yapışmasını) belirli bir homing reseptör davranmaktadır. Yapışma kaskad homing reseptörlerin belirli bir rolü tanımlamak için altın standart, bireysel floresan etiketli T hücreleri (veya hatta floresan ile işaretlenmiş diğer hücreleri veya boncuk), gerçek zamanlı olarak endotel hücreleri ile etkileşim doğrudan gözlenir intravital mikroskobu (IVM). Ancak, IVM, zaman alıcı fare anestezi gerektiren zahmetli cerrahi işlemler, ima ve etiketleme ve enjeksiyon için saf ve homojen hücre popülasyonlarının çok sayıda önceden izolasyon ihtiyacı var. Ayrıca, merkezi sinir sistemi (MSS) ve timus gibi bazı dokularda, IVM için ulaşılması zor. Son olarak, IVM hazırlıkları, karaciğer, akciğer ve bağırsak gibi bazı organlar / dokular, (IVM ayrıntılı bir tartışma için ^{ref görmek} 6) elde etmek zordur doku immobilizasyon gerektirir.

Öte yandan, homing deneyler kurmak için nispeten kolay, onlar ortak enjekte edilerek iki farklı etiketli T hücre popülasyonlarının rekabetçi yapılır ve bunlar FACS tek bir deneyde aynı anda birden fazla doku / organ ve hücre popülasyonlarının incelenmesine olanak olabilir . Homing rekabetçi bir deneyde amaç, farklı dokularda başka (farklı etiketli) T hücre popülasyonunun bir T hücre popülasyonu açısından göreli göç ne olduğunu belirlemek için. Analizlerin sonuçları HI olarak ifade olduğundan, mutlak hücre sayımı gerektirmeyen ve sonuçları, her doku izole / analiz T hücrelerinin sayısına göre ya da hayvan / organlarda nihai farklılıklar, T hücre enjekte sayısı etkilenmez boyutu.

Bu avantajlara rağmen, rekabetçi homing deneyler, T hücre göçü her dokusu içine gerçek büyüklüğü hakkında bilgi sağlamak olmadığını akılda tutulması olmalıdır. Aslında, HI, çok kötü T hücre göçü ile dokularda ve çok az T hücreleri gibi iltihaplı olmayan kolon veya MSS FACS tarafından tespit edilebileceği çok yanıltıcı olabilir (kan kontaminasyon temsil edebilecek birkaç T hücre olaylar. HI büyük değişimler neden olabilir.) Genel bir kural olarak, HI yeterli sayıda olaylar etiketli T hücre popülasyonlarının en az birinin açıkça verilen bir doku indentified böylece FACS tarafından tespit edilir sadece kullanılmalıdır.

Son olarak, rekabetçi homing deneyleri ve HI hesaplamalar ideal T hücreleri (genellikle başına bir doku 1 x 10 ⁶ toplam enjekte T hücreleri, T hücrelerinin sayısı olarak ifade edilmiştir.) Mutlak hücre sayımı ile tamamlanabilir. Ancak, her dokuda T hücrelerinin mutlak rakamlar belirlenmesi zaman alıcı ve güvenilirlik / tekrarlanabilirlik çoğu T hücreleri intravenöz enjekte edilir ve her doku verimli T hücre izolasyonu sağlamak için dikkatli enjeksiyon tekniği bağlıdır.

Özetle, biz gut-tropik ve kontrol T hücreleri arasındaki rekabet homing deneyler var. Ancak, bu yöntem diğer birçok lenfoid hücreler (örneğin, naif ya da aktive T ve B hücreleri, _T REG, vb) ve non-lenfoid hücreler (örneğin, DC, kök hücreler, vb) da uygulanabilir . Böylece, homing deneyleri, in vivo olarak hücre göç incelemek için basit, çok yönlü ve güçlü bir araç sağlar .

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).