Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

Summary

Competitiva experimentos homing permiten la evaluación directa de las propiedades migratorias de dos poblaciones diferentes de células en un ratón. Aquí se ilustra este procedimiento mediante la comparación de la migración de los ex vivo generado intestino tropicales versus no-gut células T trópico.

Abstract

Con el fin de ejercer su función de linfocitos necesidad de salir de la sangre y migran hacia los diferentes tejidos del cuerpo. La adhesión de linfocitos a las células endoteliales y la extravasación de tejido es un proceso de múltiples pasos controlados por diferentes moléculas de adhesión (receptores homing) expresa en los linfocitos y sus respectivos ligandos (addressins) que aparecen en las células endoteliales ^{1 2.} A pesar de que la función de estos receptores de adhesión puede ser parcialmente estudiado ex vivo, la prueba definitiva de su relevancia fisiológica es para evaluar su función en vivo en la adhesión de linfocitos y la migración. Dos estrategias complementarias se han utilizado para este propósito: la microscopía intravital (IVM) y los experimentos mensajeras. A pesar de IVM ha sido esencial para definir la contribución exacta de los receptores de adhesión específicas en la cascada de adherencia en tiempo real y en diferentes tejidos, IVM es mucho tiempo y mano de obra intensiva, que a menudo requiere el desarrollo de sofisticadas técnicas quirúrgicas, es necesario el aislamiento previo de homogeneidad las poblaciones de células y permite el análisis de un solo tejido / órgano en un momento dado. Por el contrario, la competencia experimentos homing permitir la comparación directa y simultánea en la migración de los dos (o más) subconjuntos de células en el mismo ratón y también permiten el análisis de muchos tejidos y de un elevado número de células en el mismo experimento.

A continuación se describe el protocolo de la competencia clásica mensajeras para determinar la ventaja / desventaja de un tipo de célula a la casa a tejidos específicos, en comparación con una población de células control. Hemos elegido para ilustrar las propiedades migratorias de la tripa-tropical frente a las células T no destripar-trópico, debido a que la mucosa intestinal es la mayor superficie del cuerpo en contacto con el medio externo y es también el tejido extra-linfoides con los requisitos de mejor definidos migratorias . Por otra parte, trabajos recientes han determinado que la vitamina A metabolito ácido trans-retinoico (RA) es el principal mecanismo molecular responsable de la inducción al intestino receptores específicos de la adhesión (integrinas receptor de quimiocinas a4b7and CCR9) en los linfocitos. Por lo tanto, fácilmente puede generar un gran número de intestino tropicales y no tropicales los linfocitos al intestino ex vivo mediante la activación de células T en la presencia o ausencia de RA, respectivamente, que pueden ser finalmente utilizado en los experimentos competitivos homing se describe aquí.

Protocol

1. Ex generación in vivo de células T del intestino-homing y control (ver Figura 1)

1. Aislar esplenocitos por maceración un bazo de ratones de tipo salvaje. Resuspender la suspensión de las células en PBS y centrifugar durante 5 minutos a 400 x g. Eliminar el sobrenadante y lisar los glóbulos rojos por la resuspensión del sedimento de células en 4 ml de solución amortiguadora de lisis ACK durante 2-3 minutos. Después de eso, añadir 5 ml de PBS. Centrifugar durante 5 'a 400 xg y eliminar el sobrenadante.
2. Resuspender esplenocitos totales de 1 x 10 ⁶ / ml en IMDM + 10% de SFB + 50 mM 2-mercaptoetanol + penicilina / estreptomicina (IMDM completo). Separar las células en dos grupos, uno de los cuales se complementa con AR (RAR o sintético-agonistas, como Am80 o Am580) a una concentración final de 100-200 Nm ^3. Las células T activadas en la presencia de RA o RAR-agonistas se upregulate a4b7and CCR9 y se convertirá en trópico intestinal de células T, mientras que las células T activadas sin la AR se convierten en células T de control.
3. Agregar 1,5-2,0 ml de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 24 pocillos previamente recubiertas con anti-CD3 (10 mg / ml) y anti-CD28 (10 mg / ml) y se incuba a 37 ° C en 5% CO ₂ (para el recubrimiento de la placa de 500 ml / pocillo de anti-CD3 más anti-CD28 en PBS y se incuba durante 2 horas a 37 ˚ C y lavar dos veces con 2 ml de PBS).
4. Con el fin de evitar la sobreestimulación de las células T, después de 2-3 días la transferencia de las suspensiones de células en una nueva sin recubrimiento de 24 pocillos. Incubar durante otros 2-3 días. Dependiendo de la densidad celular y la proliferación de los medios de comunicación puede convertirse en ácido (amarillo), en cuyo caso podría ser necesario para reemplazar la mitad de los medios de comunicación con IMDM completo fresco. Recoger las células después de 4-5 días (a contar desde el día 0).
5. Típico de los rendimientos finales son 1.2 x 10 ⁶ células T efectoras / bien. Por lo tanto, un mínimo de 12.9 de cada uno de los pozos de las células intestinales trópico-T y las células T de control debe ser recubierto con el fin de terminar con 10-20 x 10 ⁶ células T en cada condición.

2. Análisis de la tripa-homing los receptores de las células T activadas

Después de 4-5 días de cultivo se debe observar una alta expresión de la tripa-homing a4b7and CCR9 receptores en las células T activadas en la presencia de los agonistas de RA o RAR, mientras que el control de las células T que expresan niveles muy bajos de estos ^cuatro receptores.

La citometría de flujo (FACS) el análisis.

1. Recoger entre 0,2-0,5 x 10 ⁶ células y centrifugar durante 5 minutos a 300 g a 4 ° C.
2. Se incuba con anti-CD4-FITC, anti-a4b7-PE (BD Biosciences), anti-CCR9-APC (eBiosciences) y anti-CD8 PerCP por 15 min a 4 ° C en la oscuridad.
3. Después de la incubación, centrifugar durante 5 min a 300 g 4 ° C. Lavar y volver a suspender las células en buffer de tinción y análisis por FACS.

3. T marcado de células con seguidores de células CFSE y CMTMR

1. Mantenga todas las soluciones a 37 ° C antes de comenzar. Lavado de estómago-trópico células T (a4b7 ^alta CCR9 ^alta) y el control de las células T (a4b7 ^{Baja / Neg} CCR9 ^{Baja / Neg)} dos veces con PBS para eliminar el suero. Ajustar la concentración de células T de 10.15 x 10 ⁶ / ml en PBS.
2. Añadir CFSE (carboxifluoresceína succinimidil éster) o CMTMR (clorometil-benzoil-amino-tetrametilrodamina) fluoróforos a cualquiera de intestino-trópico de células T y T el control a una concentración final de 5 mm y 10 mm, respectivamente, suavemente vortex e incubar durante 20 minutos a 37 ° C. Se recomienda cambiar los etiquetados en el mismo o en otro experimento con el fin de excluir posibles efectos intrínsecos de fluoróforos en la migración de células T.
3. Después de la incubación, apagar con un volumen de FBS y se incuba durante 1-5 minutos a temperatura ambiente. Diluir 10 veces con PBS caliente y centrifugar durante 5 minutos a 300 g. Lavar dos veces con PBS y resuspender en IMDM completo.
4. Idealmente, 10-20 x 10 ⁶ células T de cada población debe ser mezclado en una proporción de 1:1 y luego se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Por último, volver a suspender las células en 200-250 ml de PBS caliente y se inyecta a través de la vena de la cola.
5. Para calcular la proporción exacta de entrada (lo ideal es cercano a 1) salvar a 5-10 ml de la suspensión de células inyectadas y se diluye con 300 ml de PBS y analizar por FACS.

4. El análisis de células T homing

Aunque los ratones pueden ser analizados en diversos puntos de tiempo (entre 1 hora y después de varios días de la inyección de células T), mensajeras de las células intestinales trópico-T es la mejor documentada entre 12-24 h después de la inyección. Ya los puntos de tiempo aumentar los posibles efectos de otras variables que afectan el número final de células / relaciones, como la apoptosis de las células T y la salida de las células T de los tejidos. Después de los ratones son suspensiones eutanasia, células de diversos tejidos deben ser aislados de inmediato a fin de reducir la muerte celular, lo que podría afectar los rendimientos y resultados finales. Los tejidos de interés son el intestino delgado, colon, bazo, ganglios linfáticos, las placas de Peyer, hígado, pulmones y sangre. Si elinyectaron células T son de buena fe trópico intestinal de células T, que debe su casa, en promedio de 5-10 veces más (o superior) a la mucosa del intestino delgado, en comparación con el control de las células T. Sin embargo, otros tejidos, como la sangre y el bazo, no debe presentar una migración de las células T preferencial. Aislamiento de linfocitos de la lámina propia intestinal y el compartimiento intraepitelial se ha descrito anteriormente ^5.

1. Tinción FACS: Las muestras se resuspendieron en función del número de células recogidas, con una densidad no superior a 3,0 x 10 ⁶ células / ml. Si congenic CD45.1 ⁺ o ⁺ Thy1.1 ratones fueron utilizados como receptores, las células se tiñen con el marcador correspondiente congenic (por ejemplo, o CD45.2 Thy1.2) en combinación con algún marcador linaje (por ejemplo, TCRbchain, CD4 y CD8 , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. Durante el análisis de FACS, las células están separadas en el marcador congenic (por ejemplo, CD45.1) y luego en los marcadores de linaje específico (por ejemplo, CD4/CD8) y se analizó la relación entre las células CFSE CMTMR y positivo.
3. Los datos generalmente se expresa como el Índice de Homing (HI), que se calcula como el cociente CFSE / CMTMR (o CMTMR / CFSE) en cada tejido, dividido por el ratio de la entrada correspondiente (ver abajo). Si la relación de entrada es muy cercano a 1, las razones de tejido será equivalente a la HI.

HI = CFSE _tejido / _tejido CMTMR: CFSE _entrada / CMTMR _entrada

La sangre también deben ser analizados con el fin de determinar si las dos poblaciones de células T están igualmente representados en la circulación, o si una población de células T es menor respecto a los otros (por ejemplo, por la captura preferencial en los pulmones / el hígado o por disminución de la viabilidad). Esto puede ocurrir cuando se comparan las células de memoria ingenua o T en reposo en comparación con hace poco activa las células T efectoras, ya que estos últimos podrían quedar atrapados en mayor medida en los pulmones. Si el HI en la sangre es significativamente diferente de 1, se puede normalizar la HI en los tejidos por la HI en la sangre. La sangre se puede obtener a través de punción cardíaca de los ratones anestesiados (con la eutanasia avertina o isofluorano antes) y deben ser lisadas dos veces con tampón ACK antes de usarlo para la tinción FACS.

Normalización de la sangre = HI _tejido / HI _sangre

5. Resultados representante

Ratones receptores (Thy1.1 ⁺⁾ fueron post euthanized18h la inyección de células. Las suspensiones celulares fueron generados a partir del bazo, los ganglios linfáticos periféricos (PLN), los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y Propia pequeña lámina de intestino (LP). Después de que las células se tiñeron de Thy1.2 y CD8 y luego analizada por FACS de gating en viable Thy1.2 ⁺ células CD8 ^+, que fueron analizados por fin de la relación entre las células CMTMR ⁺ (trópico intestinal de células T) y la CFSE ⁺ las células (control de las células T) dividida por la relación de entrada. Los resultados se pueden visualizar como se muestra en la Figura 2, en el que se puede apreciar que el trópico intestino y el control de las células T alojados también en el bazo (HI cercano a 1, se indica con una línea roja). Por el contrario, trópico intestinal de células T emigraron alrededor de 10 veces más eficiente que el LP, en comparación con el control de las células T.

Figura 1:. Esquema de la generación y el etiquetado de los intestinos-trópico y no-gut células T trópico células T son aislados de los ratones de tipo salvaje y se activa con anti-CD3/anti-CD28 y en la presencia o ausencia de 100-200 nm todos - trans del ácido retinoico (RA). Después de 4-5 días la AR tratados con células T adquieren la expresión de receptores de intestino homing CCR9 y a4b7. Entonces, trópico intestino y el control de las células T son diferencialmente etiquetados con CFSE o CMTMR, lavado, mezclado en una proporción de 1:1 y se inyecta en un ratón receptor a través de la vena de la cola. Algunas células marcadas se utilizan para determinar la relación de entradas CFSE / CMTMR (debe ser cercano a 1).

Figura 2:. Ratones Ejemplo de análisis de recalada analizado 12-18 h después de la inyección de células T y suspensiones de células individuales se obtienen de los órganos de interés. Las células se tiñeron con anti-Thy1.2 (marcador congenic), además de anti-CD8 y Thy1.2 ⁺ células T CD8 ⁺ se analizan para la relación de CMTMR ^{+ +} y CFSE células en cada tejido por FACS. El tejido CMTMR / CFSE relaciones se normalizan por la entrada CMTMR / CFSE relación para obtener los índices de homing (HI). En este ejemplo CMTMR ⁺ y ⁺ CFSE células son intestino tropicales y control de las células efectoras T, respectivamente.

Discussion

A pesar de que los experimentos homing proporcionar información muy valiosa acerca de la migración de la población total de células en un tejido determinado, se debe tener en cuenta que estos ensayos no analizan directamente de adhesión endoteliales y por lo tanto no discriminar en qué etapa (s) de la adhesión de varios pasos cascada (tethering / móvil, activación o pegue) un determinado receptor homing está actuando. El estándar de oro para definir el papel específico de los receptores de homing en la cascada de adherencia es la microscopía intravital (IVM) en la que cada etiqueta fluorescente las células T (u otras células o bolas, incluso la etiqueta fluorescente) son observadas directamente interactúan con las células endoteliales en tiempo real. Sin embargo, IVM es mucho tiempo, requiere anestesia ratón, implica laboriosos procedimientos quirúrgicos y las necesidades de aislamiento antes de un gran número de poblaciones celulares puras y homogéneas para el etiquetado y la inyección. Por otra parte, algunos tejidos, como el sistema nervioso central (SNC) y el timo, son de difícil acceso para el IVM. Por último, los preparativos IVM requieren la inmovilización de tejido que es difícil de alcanzar en algunos órganos / tejidos como el hígado, los pulmones y el intestino (para una discusión detallada sobre IVM ver ref. ^6).

Por otro lado, los experimentos homing son relativamente fáciles de instalar, que se puede hacer competitiva por la co-inyección de dos diferencialmente etiquetados poblaciones de células T, y permiten que el examen simultáneo de múltiples tejidos / órganos y las poblaciones de células en un solo experimento por FACS . En un experimento homing competitivo, el objetivo es determinar lo que es la migración familiar de uno respecto a la población de células T a otra población celular (diferente etiqueta) T en diferentes tejidos. Dado que los resultados se expresan como HI, los análisis no requieren recuentos absolutos de células y los resultados no se ven afectados por el número de inyectar las células T, por el número de aislados / analizaron las células T en cada tejido o por posibles diferencias en los animales / órganos tamaño.

A pesar de estas ventajas, hay que tener en cuenta que la competencia experimentos homing no proporcionan información sobre la magnitud real de la migración de las células T en cada tejido. De hecho, el HI puede ser muy engañoso en los tejidos con la migración de células T y muy pobres de los cuales las células T muy pocos los que pueden ser detectadas por FACS, como en el colon no inflamadas o sistema nervioso central (algunos eventos de las células T que puede representar la contaminación de sangre puede resultar en grandes variaciones en HI). Como regla general, HI debe ser utilizado solamente cuando un número suficiente de eventos son detectados por FACS, para que al menos una de las poblaciones de células T puede ser etiquetado claramente identificados en un determinado tejido.

Por último, la competencia experimentos y cálculos homing HI debería ser idealmente complementada con celda absoluta de recuento de células T (generalmente se expresa como el número de células T en un pañuelo de papel por 1 x 10 ⁶ total inyectado células T). Sin embargo, la determinación del número absoluto de células T en cada tejido es mucho tiempo y su fiabilidad / reproducibilidad dependerá de la técnica de inyección cuidado para asegurar que las células T son más inyecta por vía intravenosa y en un aislamiento eficaz de las células T de cada tejido.

En resumen, hemos descrito la competencia entre los experimentos homing intestino tropicales y control de las células T. Sin embargo, este método se puede aplicar a muchas otras células linfoides (por ejemplo, T ingenuas o activados y las células B, T _REG, etc) y también a los no-células linfoides (por ejemplo, DC, las células madre, etc.) Así, los experimentos homing proporcionar una herramienta sencilla, versátil y potente para estudiar la migración celular in vivo.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).