Summary
竞争归巢实验允许直接评估一个鼠标的两个不同的细胞群的洄游特性。在这里，我们说明了此过程中，通过对比前体内产生的肠道热带与非肠嗜T细胞迁移。
Abstract
为了发挥其功能的淋巴细胞，需要离开血液和迁移到身体的不同组织。淋巴细胞粘附于血管内皮细胞和组织外渗是一个多步骤的过程，不同的粘附分子控制（归巢受体）对淋巴细胞和各自的配体（addressins）1 2内皮细胞上显示。即使这些粘附受体的功能，可部分研究体外，其生理意义的最终测试，以评估他们的作用 ，在体内淋巴细胞的黏附和迁移。两个相辅相成的策略已经用于此目的：活体显微镜（IVM）和归巢的实验。虽然IVM必须确定精确的实时性和在不同组织中的粘附级联在特定的粘附受体的贡献，IVM的是耗费时间和劳动力密集，往往需要复杂的外科技术的发展，它需要同质化的前隔离细胞群，它允许在任何给定的时间只有一个组织/器官的分析。与此相反，有竞争力的归巢实验允许的直接同步比较，在相同的鼠标在两个移民（甚至更多）的细胞亚群，他们还允许许多组织和分析大量的细胞在相同的实验。
在这里，我们描述古典的竞争归巢的协议，用于特定组织，以确定一个给定的细胞类型的优势/缺点相比，控制细胞群。我们选择来说明肠道热带与非肠道嗜T细胞的迁徙，因为肠道黏膜是与外部环境最大的身体接触表面，它也是与最好的定义的迁徙要求额外的淋巴组织。此外，最近的工作已经确定，维生素代谢产物的全反式维甲酸（RA）诱导淋巴细胞的肠道特异性粘附受体（整合a4b7and趋化因子受体CCR9）负责的主要分子机制。因此，我们可以很容易地通过激活T细胞在RA的存在或缺乏肠道热带和非肠道嗜淋巴细胞体外大量产生，分别，终于可以在这里所描述的竞争归巢实验。
Protocol
1。 前肠道归巢和控制T细胞的体内产生（见图1 ）
- 隔离糖化从野生型小鼠脾脾。在PBS的细胞悬液，离心重悬为5 400 × G.取出上清液和裂解红细胞resuspending在2-3分钟的ACK裂解液4毫升细胞沉淀。之后，添加5毫升的PBS。 5 400 XG离心去除上清。
- 总脾重悬在1 × 10 6 /毫升的IMDM + 10％FBS + 50毫米2 -巯基乙醇+青霉素/链霉素（完整的IMDM）。分开两组，其中之一是与RA（或合成的RAR -受体激动剂，如Am80或Am580）补充到终浓度为100-200纳米3细胞。活化的T细胞在RA或RAR -受体激动剂的存在将上调a4b7and CCR9，将成为肠道嗜T细胞，而没有天雨激活的T细胞将成为控制T细胞。
- 添加1.5-2.0毫升细胞悬液，每孔以前涂有抗CD3（10毫克/毫升）和抗CD28（10毫克/毫升）24孔板和37 °彗星在5％CO2 2（涂层板加500毫升/抗CD3加抗CD28在PBS孵育2小时，在37˚C，然后用2 ml PBS洗两次）。
- 为了避免T细胞的过度刺激，转移到一个新的无涂层的24孔板中的细胞悬浮液后2-3天。孵育2-3天。根据细胞密度和增殖的媒体可能成为酸（黄色），在这种情况下，它可能是需要更换新鲜完整的IMDM媒体的一半。收获后4-5天（从0天算起）的细胞。
- 典型的最终产量是1-2 × 10 6个效应T细胞/孔。因此，应至少每肠道嗜T细胞和控制T细胞9-12井镀以10-20 × 10 6 T细胞每条件。
2。肠道归巢受体激活T细胞的分析
经过4-5天的文化，我们应该观察肠道归巢受体的T细胞激活在RA或RAR激动剂的存在，而控制T细胞表达非常低的水平， 这些受体4 a4b7and CCR9的高表达。
流式细胞术（FACS）分析。
- 收集0.2-0.5 × 10 6细胞和离心5分钟在300克之间，4 ° C 。
- 抗CD4 - FITC，抗- a4b7 - PE（BD公司），抗CCR9 - APC（eBiosciences）和抗- CD8 - PercP孵育15分钟，4 °在C黑暗。
- 孵化后，300克4 ° C离心5分钟染色缓冲液洗和重悬细胞，并用流式细胞仪分析。
3。 T与CFSE和CMTMR细胞跟踪细胞标记
- 所有的解决方案保持在37℃前开始。清洗肠道嗜T细胞（a4b7 高 CCR9 高 ）和控制T细胞（a4b7 低/负 CCR9 低/ NEG）的两倍，用PBS去除血清。调节T细胞浓度为10-15 × 10 6 /毫升的PBS。
- CFSE（羧基琥珀酰亚胺酯）或CMTMR（氯苯甲酰氨基-四甲）荧光团，无论是肠道嗜T和控制T细胞的终浓度为5毫米和10毫米，分别轻轻旋涡和20分钟的孵育37 ° C。建议交换在相同或在另一项实验中，为了排除潜在的内在影响，对T细胞迁移荧光团的标号。
- 孵化后，淬火1 FBS和孵化量在室温下为1-5分钟。用温PBS稀释10倍，离心5分钟，300克。洗净，用PBS重悬在完成IMDM两次。
- 10-20 × 10 6细胞的每个T人口理想的情况下，应以1:1的比例混合，然后在5分钟的300 XG离心。最后，在200-250毫升的温暖PBS重悬细胞和经尾静脉注入。
- 为了计算出准确的投入比例（理想接近1）保存5-10毫升注入细胞悬液和300毫升的PBS稀释，并用流式细胞仪分析。
4。分析的T细胞归巢
虽然可以在不同时间点（1小时，几天后T细胞注射）分析小鼠，肠嗜T细胞归巢是最好的记录之间的12-24小时后注射。更长的时间点增加影响的最后一个单元格的数字/比率，如T细胞凋亡和T细胞从组织退出，其他变量的潜在影响。后的小鼠安乐死，从几个组织的细胞悬浮液，应毫不迟延地隔离，以减少细胞死亡，这可能会影响最终的产量和结果。利益的组织是小肠，结肠，脾，淋巴结肿大，Peyer氏斑，肝，肺和血液。如果注射T细胞是真正的肠嗜T细胞，它们应该平均5-10倍（或更高）的小肠黏膜相比，控制T细胞的家庭。然而，其他组织，如血液和脾脏，不应该表现出了优惠的T细胞迁移。淋巴细胞从肠道固有层和上皮内舱分离先前已经描述5。
- 流式细胞仪染色：样品是根据收集的密度不超过3.0 × 10 6细胞/ ml，悬浮细胞的数量。如果congenic CD45.1 +或Thy1.1 +小鼠作为接受者，与相 应congenic的标记（例如，CD45.2或Thy1.2结合一些宗族标记（例如，TCRbchain，CD4 +，CD8 +细胞染色） ，CD45.1 + / CD45.2 +）。
- 在流式细胞仪分析，细胞是门上的congenic标记（例如CD45.1），然后对具体的血统标志物（如CD4/CD8比值）和CMTMR和CFSE阳性细胞之间的比率分析。
- 通常表示为归位指数（HI），这是计算的比例CFSE / CMTMR除以相应的输入比例（见下文）每一个组织（或CMTMR / CFSE）的数据。如果输入的比例是非常接近1，然后组织比率将相当于所喜。
您好= CFSE 组织 / CMTMR 组织 ：CFSE 输入 / CMTMR 输入
血也应该加以分析，以确定两个T细胞群是否平等的代表在流通领域中，如果一个T细胞的人口减少了其他方面（例如，在肺/肝优惠诱捕或下降的可行性）。可能发生这种情况时比较天真或休息的记忆性T细胞与最近激活的效应T细胞，因为后者可能会在更大程度上被困在肺部。如果血液中的HI是明显大于1的不同，可以在血液您好您好正常化组织。血液可通过从小鼠心脏穿刺麻醉avertin或isofluorane之前安乐死，并应与前两次使用流式细胞仪染色的ACK缓冲裂解。
血液正常化=您好组织 /嗨血
5。代表性的成果
受体小鼠（Thy1.1 +）euthanized18h后的细胞注射。从脾，外周淋巴结（PLN），肠系膜淋巴结（MLN）和小肠椎板propia（LP）产生的细胞悬浮液。之后染色Thy1.2和CD8细胞，然后用流式细胞仪分析可行Thy1.2 + CD8 +细胞，这是最后CMTMR +细胞（肠嗜T细胞）和CFSE之间的比例分析浇注 +细胞（控制T细胞）除以投入比。结果可以显示在图2所示，其中肠道热带和控制T细胞同样归属脾（您好关闭TO1，用一根红线表示），可以欣赏。相比之下，肠道嗜T细胞迁移的10倍左右，更有效的唱片相比，控制T细胞。
图1：被隔离。图显示肠道热带和非肠嗜T细胞的生成和标签的T细胞和野生型小鼠与anti-CD3/anti-CD28在100-200纳米的存在或缺席所有激活- 反式维甲酸（RA）的。经过4-5天的RA治疗T细胞获得肠道CCR9和a4b7归巢受体的表达。然后，肠道热带和控制T细胞的差异标记CFSE或CMTMR，洗净，以1:1的比例混合成收件人小鼠经尾静脉注射。一些标记的细胞被用来确定CFSE / CMTMR输入比率（应接近1）。
图2：归位分析的例子 。小鼠分析h后12-18 T细胞注射液和单细胞悬液，获得利益的机关。细胞染色，抗- Thy1.2（congenic标志），加上抗CD8，然后Thy1.2 + CD8 + T细胞CMTMR比例分析 +和CFSE +各组织细胞，用流式细胞仪。组织CMTMR / CFSE比率，然后输入CMTMR / CFSE比例归一，以获取指数（HI）的归位。在这个例子中CMTMR +和CFSE +细胞是肠道热带和控制效应T细胞，分别。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
即使归巢的实验提供了非常宝贵的有关在任何特定的组织细胞总人口的迁移的信息，应牢记这些实验不直接分析内皮细胞粘附，因此不歧视的多级粘连步骤（S）级联（圈养/滚动，激活或坚持）一个给定的归巢受体行事。黄金标准中定义的粘附级联的归巢受体的具体的作用，是活体显微镜（IVM），其中个人荧光标记的T细胞（或其他细胞，甚至荧光标记的珠）直接观察与内皮细胞的实时交互。然而，IVM的是费时，需要鼠标麻醉，意味着艰苦的手术过程中，需要大量纯标签和注射和同质的细胞群前的隔离。此外，一些组织，如中枢神经系统（CNS）和胸腺，是很难为IVM的访问。最后，IVM的准备工作需要组织固定，是难以实现，在某些器官/组织，如肝，肺和小肠，（对IVM的详细讨论见文献 6 ）。
另一方面，归巢的实验比较容易成立，他们可以做竞争力的合作注入两个不同的标记的T细胞群，而且它们允许在一个单一的实验用流式细胞仪同时检查多个组织/器官和细胞群。在竞争激烈的归巢实验的目的是为了确定什么是一个T细胞人口方面的另一个差异标记T在不同的组织细胞群的相对迁移。分析结果表示您好，不要求绝对细胞计数，注入的T细胞数量隔离/分析T细胞的数量在每个组织或动物/器官的最终差异的结果不会受到影响，大小。
尽管有这些优势，应该牢记，竞争的归巢实验不提供有关T细胞迁移到每个组织的实际规模的信息。事实上，您好可以在很差的T细胞迁移的组织，并从其中极少数的T细胞可以通过流式细胞仪检测，如在非发炎的结肠或中枢神经系统非常误导的（少数T细胞可能代表血液污染的事件可以您好巨大变化的结果）。作为一般规则，HI，应使用只用流式细胞仪检测，这样至少可以清楚地标记的T细胞群在给定的组织indentified的事件时有足够数量。
最后，有竞争力的归巢的实验和喜计算应绝对细胞计数T细胞（通常表示为每1 × 10 6总注入T细胞组织中的T细胞数量）的理想补充。然而，决定在每个组织中的T细胞的绝对数量非常耗时，而且取决于它的可靠性/重复性小心注射技术，以确保大多数T细胞静脉注射，并从每个组织的高效性T细胞隔离。
总之，我们所描述的肠道热带和控制T细胞之间的竞争归巢实验。但是，这种方法可以应用到许多其他淋巴样细胞（例如，天真或激活的T和B细胞，T REG，等等），也非淋巴细胞（例如，直流，干细胞等）。因此，归巢的实验研究体内细胞迁移提供了一种简单，灵活，功能强大的工具。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
合资是由来自美国S＆结肠炎克罗恩基金会（CCFA）的奖学金支持。 JRM是支持由中国连锁经营协会，癌症研究所（CRI）的，霍华德H.古德曼（MGH），马萨诸塞州的生命科学中心（MLSC）和美国国立卫生研究院主任最新创新奖助学金。
Materials
| Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). | |||
| Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol. | |||
| ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature). | |||
| PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). | |||
| Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case. | |||
| T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C. | |||
| Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies. | |||
| Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). | |||
| All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA). |
References
- Butcher, E. C. Leukocyte-endothelial cell recognition: Three (or more) steps to specificity and diversity. Cell. 67, 1033-1036 (1991).
- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Iwata, M. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21, 527-538 (2004).
- Mora, J. R. Reciprocal and dynamic control of CD8 T cell homing by dendritic cells from skin- and gut-associated lymphoid tissues. J Exp Med. 201, 303-316 (2005).
- Mora, J. R. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer's patch dendritic cells. Nature. 424, 88-93 (2003).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
