מבחני ביות תחרותי לחקר נדידת גוט-טרופי T Cell

Summary

ניסויים ביות תחרותי לאפשר ישירות להעריך את מאפייני הנדידה של שתי אוכלוסיות תאים שונות עכבר אחת. כאן אנו מדגימים הליך זה על ידי השוואת ההגירה לשעבר טרופי-vivo הבטן שנוצר לעומת אי - טי בטן תאים טרופי.

Abstract

על מנת להפעיל לימפוציטים תפקידם צריכים לעזוב את הדם ולנדוד לרקמות שונות בגוף. הידבקות הלימפוציטים לתאי האנדותל extravasation רקמות הוא תהליך רב שלבי נשלט על ידי מולקולות הדבקה שונות (קולטנים ביות) הביע על לימפוציטים ו ligands שלהם (addressins) מוצג לתאי אנדותל ^{1 2.} אף על פי פונקציה של קולטנים אלה הדבקה ניתן ללמוד באופן חלקי לשעבר vivo, את המבחן האולטימטיבי רלוונטיות פיזיולוגיים שלהם הוא להעריך את תפקידם במהלך הידבקות ב לימפוציטים הגירה vivo ו. שתי אסטרטגיות משלימות שימשו למטרה זו: מיקרוסקופיה intravital (IVM) וניסויים ביות. למרות IVM כבר חיוני להגדיר את התרומה המדויקת של הידבקות קולטנים ספציפיים במהלך מפל הידבקות בזמן אמת ברקמות שונות, IVM היא זמן רב ועבודה אינטנסיבית, לעתים קרובות מחייב פיתוח של שיטות ניתוח מתוחכם, הוא צריך בידוד מראש של הומוגנית אוכלוסיות תאים וזה מאפשר ניתוח של איבר אחד בלבד רקמה / בכל זמן נתון. לעומת זאת, ניסויים ביות תחרותי לאפשר השוואה ישירה סימולטני הגירה של שני (או אפילו יותר) תת תא העכבר אותו והם גם היתר ניתוח של רקמות רבות של מספר גבוה של תאים בניסוי זהה.

כאן אנו מתארים את פרוטוקול קלאסית ביות תחרותי בשימוש כדי לקבוע את היתרון / חיסרון של סוג תא נתון לבית לרקמות ספציפיות לעומת האוכלוסייה תא שליטה. בחרנו להדגים את מאפייני הנדידה של טרופי בטן לעומת הלא קרביים טרופי בתאי T, כי רירית המעי הוא משטח הגוף הגדול ביותר במגע עם הסביבה החיצונית, והיא גם רקמת הלימפה במיוחד עם מיטב מוגדרים דרישות הנדידה . יתר על כן, העבודה האחרונה קבעה כי הוויטמין חומצה המטבוליט כל טרנס retinoic (ע"ר) הוא המנגנון המולקולרי האחראי העיקרי גרימת בטן ספציפי קולטנים הידבקות (integrin קולטן a4b7and chemokine CCR9) על לימפוציטים. לפיכך, אנו יכולים בקלות ליצור מספר רב של vivo לשעבר מעיים טרופי ולא מעיים טרופי ידי הפעלת לימפוציטים ותאי T בנוכחות או היעדרו של RA, בהתאמה, אשר ניתן להשתמש בהם בסופו של דבר בניסויים ביות תחרותי המתואר כאן.

Protocol

1. Ex vivo הדור של תאים T מעיים ביות ושליטה (ראה תרשים 1)

1. בודד splenocytes מוחצים one טחול מעכברים סוג בר. Resuspend ההשעיה תאים PBS ו צנטריפוגות במשך 5 'ב 400 x ז הסר את supernatant ו lyse את כדוריות הדם האדומות על ידי resuspending התא גלולה של 4 מ"ל של חיץ תמוגה ACK עבור 2-3 דקות. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל של PBS. צנטריפוגה עבור 5 'ב XG 400 ולהסיר את supernatant.
2. Resuspend splenocytes סך של 1 x 10 ⁶ / מ"ל ב IMDM + 10% FBS + 50 מ"מ + 2-mercaptoethanol פניצילין / סטרפטומיצין (IMDM מלא). הפרד את התאים לשתי קבוצות, שאחת מהן היא להשלים עם RA (או סינתטיים RAR-אגוניסטים, כגון Am80 או Am580) לריכוז סופי של nM 100-200 ^3. בתאי T מופעל בנוכחות של RA או RAR-אגוניסטים יהיה upregulate a4b7and CCR9 ויהפוך מעיים טרופי בתאי T, בעוד שתאי T מופעלים ללא RA יהפכו T תאים שליטה.
3. הוסף 1.5-2.0 מ"ל של ההשעיה התא היטב בכל צלחת 24 באר מצופה בעבר עם אנטי CD3 (10 מ"ג / מ"ל) אנטי CD28 (10 מ"ג / מ"ל) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 5% ₂ (לציפוי הצלחת להוסיף 500 מ"ל / היטב אנטי CD3 בתוספת אנטי CD28 ב PBS ו דגירה עבור 2 שעות 37 ˚ C ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 2 מ"ל PBS).
4. כדי למנוע גירוי יתר תא T, לאחר 2-3 ימים להעביר את המתלים התא לתוך צלחת חדשה 24 גם ללא ציפוי. דגירה של 2-3 ימים נוספים. בהתאם צפיפות התאים ואת ריבוי כלי התקשורת עלול להיות חומצה (צהוב), ובמקרה זה עשוי להיות נחוץ כדי להחליף מחצית התקשורת עם IMDM שלם טרי. קציר התאים לאחר 4-5 ימים (הספירה מהיום 0).
5. התשואות הסופי אופייניות הן 1-2 x 10 ⁶ תאים T מפעיל / היטב. לכן, מינימום של 9-12 בארות של כל המעי, ותאי T טרופי ושליטה בתאי T צריך להיות מצופה על מנת בסופו של דבר עם 10-20 x 10 ⁶ תאים T לכל מצב.

2. ניתוח מעיים ביות על הפעלת קולטנים בתאי T

לאחר 4-5 ימים של תרבות אנחנו צריכים לצפות ביטוי גבוה של רצפטורים מעיים ביות a4b7and CCR9 על שתאי T מופעלים בנוכחות אגוניסטים RA או RAR, בעוד בקרה בתאי T צריך להביע רמות נמוכות מאוד של קולטנים אלה ^4.

Cytometry זרימה (FACS) ניתוח.

1. איסוף בין 0.2-0.5 x10 ⁶ תאים בצנטריפוגה במשך 5 דק 'ב 300 גר' ב 4 ° C.
2. דגירה עם אנטי CD4-FITC, אנטי a4b7-PE (BD Biosciences), אנטי CCR9-APC (eBiosciences) ואנטי CD8-PercP במשך 15 דקות ב 4 ° C בחושך.
3. לאחר דגירה, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 300 גרם 4 ° C. לשטוף ו resuspend התאים מכתים חיץ ולנתח ידי FACS.

3. תיוג תא T עם עוקבים CFSE ו CMTMR תא

1. שמור את כל הפתרונות על 37 מעלות צלזיוס לפני שמתחילים. לשטוף מעיים טרופי ותאי T (a4b7 ^גבוהה CCR9 ^גבוהה) ושליטה בתאי T (a4b7 ^{נמוכה / נג} CCR9 ^{נמוכה / נג)} פעמיים עם PBS להסיר את בסרום. התאם את הריכוז תא T ל 10-15 x 10 ⁶ / מ"ל PBS.
2. הוסף CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl אסתר) או CMTMR (chloromethyl-בנזואיל-amino-tetramethylrhodamine) fluorophores אל T-טרופי או בטן מלאה בתאי T ריכוז סופי של 5 מ"מ ו 10 מ"מ, בהתאמה, מערבולת בעדינות דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C. מומלץ להחליף את labelings באותו או בניסוי נפרד על מנת למנוע תופעות מהותי הפוטנציאל של fluorophores על נדידת תאים טי.
3. לאחר דגירה, להרוות עם נפח של 1 FBS ו דגירה של 1-5 דקות בטמפרטורת החדר. מדולל 10 פעמים עם PBS חם צנטריפוגות 5 דקות ב 300 גרם שטפו פעמיים עם PBS ו resuspend ב IMDM להשלים.
4. באופן אידיאלי, 10-20 x 10 ⁶ התאים של כל האוכלוסייה T צריכה להיות מעורבת ביחס של 1:1 ולאחר מכן centrifuged XG ב 300 דקות 5. לבסוף, resuspend התאים 200-250 מ"ל של PBS חמה מזריקים דרך וריד הזנב.
5. כדי לחשב את יחס קלט המדויק (רצוי קרוב ל 1) לחסוך 5-10 מ"ל של השעיה התא שהוחדר ו לדלל עם 300 מ"ל של PBS ולנתח ידי FACS.

4. ניתוח של תא T ביות

אמנם בעכברים ניתן לנתח בנקודות זמן שונות (בין 1 שעות שלאחר מספר ימים הזרקת תא T), ביות של המעיים ותאי T-טרופי מתועדת הטוב ביותר בין 12-24 שעות שלאחר ההזרקה. נקודות זמן רב יותר להגדיל את ההשפעות האפשריות של משתנים אחרים המשפיעים על התא האחרון מספרים / יחסי, כמו אפופטוזיס תא T ו-T תא יציאה מן הרקמה. לאחר בעכברים מורדמים, השעיות תאים מרקמות כמה צריך להיות מבודד ללא דיחוי על מנת להקטין מוות של תאים, אשר עשויים להשפיע על התשואות הסופי ואת התוצאות. רקמות של עניין הם המעי הגס קטן, הטחול, בלוטות הלימפה, תיקונים של Peyer, כבד, ריאות ודם. אםבתאי T מוזרק הם בתום לב מעיים טרופי בתאי T, הם צריכים בית על פי 50-10 בממוצע טוב יותר (או יותר) על רירית המעי הדק לעומת בקרה בתאי T. עם זאת, רקמות אחרות, כגון דם הטחול, לא צריך להציג הגירה מועדף תא T. בידוד של לימפוציטים מתוך lamina propria במעי תא intraepithelial תוארה בעבר ^5.

1. מכתים FACS: דוגמאות הן resuspended תלוי במספר התאים שנאספו, בצפיפות לא גבוהה יותר מאשר 3.0 x 10 ⁶ תאים / מ"ל. אם congenic CD45.1 ^{+ +} או Thy1.1 עכברים ששימשו נמענים, התאים הם מוכתמים סמן congenic המתאים (למשל, CD45.2 או Thy1.2) בשילוב עם סמן כמה השושלת (למשל, TCRbchain, CD4, CD8 , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. במהלך ניתוח FACS, תאים מגודרת על סמן congenic (למשל CD45.1) ולאחר מכן על סמנים ספציפיים השושלת (למשל CD4/CD8) ונותחו על היחסים בין CMTMR ותאי CFSE חיובית.
3. הנתונים בא לידי ביטוי בדרך כלל מדד ביות (HI), אשר מחושב CFSE היחס / CMTMR (או CMTMR / CFSE) ברקמות בכל חלקי יחס הקלט המתאים (ראה להלן). אם יחס קלט קרוב מאוד 1, ולאחר מכן את רקמת היחסים יהיה שווה ערך ל HI.

היי = _רקמה / CMTMR _רקמות CFSE: _קלט / _קלט CMTMR CFSE

דם צריך גם להיות מנותח על מנת לקבוע אם הן אוכלוסיות תאים T מיוצגים באופן שווה במחזור הדם או אם אוכלוסיית תאים T יורדת ביחס אחרות (למשל, על ידי לכידה מועדף בריאות / כבד או הכדאיות ירד). זה עלול לקרות כאשר משווים נאיבי או מנוחה לתאי T זיכרון לעומת הופעל לאחרונה בתאי T מפעיל, שכן האחרון עלול להיות לכודים במידה רבה יותר בתוך הריאות. אם HI בדם היא שונה משמעותית מ 1, אפשר לנרמל HI ברקמות ידי HI בדם. דם ניתן להשיג באמצעות לנקב לב מעכברים הרדים (עם המתת חסד Avertin או isofluorane מראש) ויש lysed פעמיים לפני השימוש בו מכתים FACS עם חיץ ACK.

נורמליזציה דם = HI _רקמה / HI _דם

5. נציג תוצאות

עכברים נמען (Thy1.1 ⁺⁾ היו תאים euthanized18h הזרקת הודעה. המתלים Cell נוצרו מן הטחול, בלוטות הלימפה ההיקפית (PLN), בלוטות לימפה mesenteric (mln) ובמעי הדק lamina propia (LP). לאחר שהתאים היו מוכתמים עבור Thy1.2 ו CD8 ולאחר מכן נותחו על ידי FACS gating על ידי קיימא Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ תאים, אשר נבדקו לבסוף על היחס בין CMTMR תאים ⁺ (מעיים טרופי ותאי T) ו CFSE ⁺ תאים (שליטה ותאי T) מחולק יחס קלט. התוצאות יכול להיות מוצג כפי שמוצג באיור 2, שבו ניתן להעריך כי מעיים טרופי ושליטה בתאי T התבייתו שווה על הטחול (HI קרוב to1, ציין עם קו אדום). לעומת זאת, הבטן טרופי בתאי T היגרו כ -10 פעמים יותר ביעילות LP לעומת בקרה בתאי T.

Figure1:. דיאגרמה המציגה את הדור וסימון של טרופי בטן ולא במעיים טרופי T לתאים ותאי T מבודדים מעכברים סוג בר מופעל עם anti-CD3/anti-CD28 ועל נוכחות או היעדר של 100-200 nM כל - טרנס retinoic חומצה (ע"ר). לאחר 4-5 ימים RA שטופלו תא T תרכוש את הביטוי של קולטנים ביות בטן CCR9 ו a4b7. ואז, מעיים טרופי ושליטה בתאי T מסומנים באופן דיפרנציאלי עם CFSE או CMTMR, שטף, מעורבת ביחס של 1:1 ו מוזרק עכבר לנמען דרך וריד הזנב. תאים מסוימים שכותרתו משמשות כדי לקבוע את היחס CFSE / CMTMR קלט (יש קרוב ל 1).

Figure2:. עכברים דוגמה של ניתוח ביות ניתח 12-18 שעות שלאחר הזרקת T התא השעיות תא בודד מתקבלים איברים של עניין. התאים הם מוכתמים אנטי Thy1.2 (סמן congenic) בתוספת אנטי CD8 ואז Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ T תאים מנותחים על יחס של CMTMR ^{+ +} ו CFSE תאים ברקמות על ידי כל FACS. CMTMR / CFSE יחסי רקמה מנורמל אז לפי היחס בין קלט CMTMR / CFSE כדי להשיג את מדדי ביות (HI). ב ⁺ דוגמה זו CMTMR ו CFSE תאים ⁺ הם מעיים טרופי ועל מפעיל בקרה בתאי T, בהתאמה.

Discussion

למרות ניסויים ביות לספק מידע בעל ערך רב על הגירה של אוכלוסיות תאים ברקמות סך נתון, יש לזכור כי מבחני אלו אינן ישירות לנתח הידבקות האנדותל, ולכן לא להפלות שבו צעד (ים) של הידבקות רב שלבי אשד (קשירה / מתגלגל, הפעלה או דבק) קולטן ביות נתון פועל. תקן הזהב להגדיר את התפקיד הספציפי של קולטנים ביות במפל את הידבקות היא מיקרוסקופית intravital (IVM) שבו שכותרתו fluorescently אדם ותאי T (או תאים אחרים או חרוזים שכותרתו אפילו fluorescently) הם נצפו ישירות אינטראקציה עם לתאי אנדותל בזמן אמת. עם זאת, IVM זמן רב, דורש הרדמה העכבר, מרמז על הליכים כירורגיים מייגע והצרכים בידוד מראש של מספר גדול של אוכלוסיות תאים טהור הומוגנית עבור תיוג ההזרקה. יתר על כן, כמה רקמות, כגון מערכת העצבים המרכזית (CNS) ואת בלוטת התימוס, קשה גישה IVM. לבסוף, דורשים הכנות IVM immobilization רקמות שקשה להשיג בכמה איברים / רקמות, כגון הריאות הכבד והמעי (לדיון מפורט על IVM לראות נ"צ. ^6).

מצד שני, ניסויים ביות קל יחסית להגדיר, הם יכולים להיעשות על ידי שיתוף תחרותי הזרקת שתי האוכלוסיות שכותרתו דיפרנציאלי תא T, והם מאפשרים בחינה בו זמנית של רקמות / איברים מרובים אוכלוסיות תאים בניסוי יחיד על ידי FACS . בניסוי ביות תחרותי המטרה היא לקבוע מה ההגירה ביחס של אחד כבוד תא T האוכלוסייה לאוכלוסייה אחרת T (שכותרתו דיפרנציאלי) תא ברקמות שונות. מאז התוצאות מבוטאות HI, מנתח את לא דורשים ספירת מוחלטת לתא ואת התוצאות אינן מושפעות ממספר תאים T מוזרק, במספר תאים בודדים T / ניתח ברקמה או על ידי כל ההבדלים בסופו של דבר בבעלי חיים / איברים גודל.

למרות יתרונות אלה, יש לזכור כי הניסויים ביות תחרותי לא לספק מידע על גודל בפועל של נדידת תאים T לרקמת כל אחד. למעשה, היי יכול להיות מטעה מאוד ברקמות עם הגירה T עניים מאוד התא שממנו בתאי T מעט מאוד ניתן להבחין באמצעות FACS, כגון המעי הגס לא מודלק או מערכת העצבים המרכזית (כמה אירועים T התא עשוי לייצג זיהום דם יכול התוצאה וריאציות ענק HI). ככלל, HI יש להשתמש רק כאשר מספר מספיק של אירועים מזוהים על ידי FACS, כך לפחות אחד אוכלוסיות תאים הנקרא T ניתן indentified בבירור רקמה מסוימת.

לבסוף, ניסויים ביות תחרותי חישובים HI צריך להיות אידיאלי כהשלמה עם מוחלטת לתא ספירה של תאים T (ביטוי בדרך כלל במספר תאים T בתוך הרקמה לכל 1 x 10 ⁶ תאים מוזרקים סך T). עם זאת, בקביעת במספרים מוחלטים של תאים T ברקמת כל זמן רב והאמינות שלו / שחזור יהיה תלוי בטכניקת הזרקה זהירה כדי להבטיח כי תאי T ביותר הם מוזרק לווריד ועל בידוד יעיל תא T מרקמות כל אחד.

לסיכום, תיארנו ניסויים ביות תחרותי בין טרופי בטן ו-T לתאים שליטה. עם זאת, בשיטה זו ניתן ליישם הלימפה תאים רבים אחרים (למשל, T נאיבי או מופעל ותאי B, T _REG וכו ') וגם לא הלימפה תאים (לדוגמה, DC, בתאי גזע, וכו'). לפיכך, ניסויים ביות לספק כלי פשוט, תכליתי ורב עוצמה ללמוד נדידת תאים in vivo.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).