Summary
प्रतियोगी घर वापस आना प्रयोगों के लिए सीधे एक माउस में दो अलग अलग सेल आबादी के प्रवासी गुण का आकलन करने की अनुमति देते हैं. यहाँ हम पूर्व vivo उत्पन्न आंत - रेखा बनाम गैर पेट रेखा टी कोशिकाओं के प्रवास की तुलना द्वारा इस प्रक्रिया का वर्णन.
Protocol
पेट घर वापस आना और नियंत्रण टी कोशिकाओं के एक पूर्व vivo पीढ़ी (चित्रा 1 देखें)
- जंगली प्रकार चूहों से एक तिल्ली mashing द्वारा splenocytes पृथक. 5 400 x जी 'पीबीएस में कोशिकाओं निलंबन और अपकेंद्रित्र Resuspend निकालें सतह पर तैरनेवाला और 2-3 मिनट के लिए ACK lysis बफर के 4 मिलीलीटर में सेल गोली resuspending द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं lyse. उसके बाद, पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें. 5 400 XG पर 'अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- 1 में कुल splenocytes Resuspend x 10 6 IMDM में / एमएल + 10% FBS + 50 मिमी 2 - mercaptoethanol + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पूरा IMDM). दो समूहों, जिनमें से एक आरए (या सिंथेटिक Am80 या Am580 जैसे RAR-agonists,) के साथ 100-200 3 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पूरक है कोशिकाओं को अलग. आरए या RAR-agonists की उपस्थिति में सक्रिय टी कोशिकाओं CCR9 a4b7and upregulate और आंत - रेखा टी कोशिकाओं बन जाएगा, जबकि आरए बिना सक्रिय टी कोशिकाओं नियंत्रण टी कोशिकाओं बन जाएगा.
- 24 अच्छी तरह से पहले (10 मिलीग्राम / एमएल) विरोधी CD3 और विरोधी CD28 (10 मिलीग्राम / एमएल) के साथ लेपित प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल निलंबन के 1.5-2.0 एमएल जोड़ें और 37 पर सेते ° सी में 5% सीओ 2 (कोटिंग के लिए प्लेट 500 / अच्छी तरह से विरोधी CD3 मिलीलीटर से अधिक 37 पर 2 घंटे के लिए पीबीएस और सेते में विरोधी CD28 जोड़ने ° सी और फिर 2 मिलीलीटर पीबीएस के साथ दो बार धोने) .
- आदेश में टी सेल overstimulation से बचने के लिए, 2-3 दिनों के बाद एक नया uncoated 24 अच्छी तरह से थाली में सेल निलंबन हस्तांतरण. अतिरिक्त 2-3 दिनों के लिए सेते हैं. मीडिया सेल घनत्व और प्रसार पर निर्भर करता है (पीला) एसिड, जो मामले में यह ताजा पूरा IMDM के साथ मीडिया के आधे की जगह के लिए आवश्यक हो सकता है हो सकता है. 4-5 दिन (0 दिन से गिनती) के बाद कोशिकाओं हार्वेस्ट.
- ठेठ अंतिम पैदावार 1-2 x 10 / 6 effector टी कोशिकाओं में अच्छी तरह से कर रहे हैं. इसलिए, 9-12 प्रत्येक आंत - रेखा टी कोशिकाओं और नियंत्रण टी कोशिकाओं के कुओं की एक न्यूनतम के क्रम में 10-20 x 10 6 हालत प्रति टी कोशिकाओं के साथ अंत चढ़ाया जाना चाहिए .
2. पेट - घर वापस आना रिसेप्टर्स सक्रिय टी कोशिकाओं पर विश्लेषण
संस्कृति के 4-5 दिनों के बाद हम आरए या RAR agonists की उपस्थिति में सक्रिय है, जबकि नियंत्रण टी कोशिकाओं इन 4 रिसेप्टर्स की बहुत कम स्तर व्यक्त करना चाहिए टी कोशिकाओं पर पेट - घर वापस आना CCR9 a4b7and रिसेप्टर्स के एक उच्च अभिव्यक्ति का पालन करना चाहिए.
प्रवाह cytometry विश्लेषण (FACS).
- 4 में 300 ग्राम से कम 5 मिनट के लिए 0.2-0.5 x10 6 कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र के बीच लीजिए डिग्री सेल्सियस
- 4 में 15 मिनट ° सी अंधेरे में के लिए विरोधी सीडी 4 - FITC, विरोधी a4b7 पीई (बी बायोसाइंसेज), विरोधी CCR9 APC (eBiosciences) और विरोधी CD8-PercP के साथ सेते हैं.
- ऊष्मायन के बाद, 300 पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र जी 4 ° सी. धो और बफर धुंधला में कोशिकाओं resuspend और FACS द्वारा विश्लेषण.
3. CFSE और CMTMR सेल trackers के साथ टी सेल लेबलिंग
- 37 पर सभी समाधान रखें ° C शुरू करने से पहले. धो पेट - रेखा टी कोशिकाओं (a4b7 उच्च उच्च CCR9) और नियंत्रण टी कोशिकाओं (a4b7 कम / Neg CCR9 कम / Neg) PBS के साथ दो बार सीरम हटायें . 10-15 6 x 10 / पीबीएस में एमएल टी सेल एकाग्रता समायोजित करें.
- या तो आंत - रेखा टी और नियंत्रण टी कोशिकाओं को 5 मिमी और 10 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर) या (chloromethyl - benzoyl एमिनो tetramethylrhodamine) CMTMR fluorophores, जोड़ें क्रमशः धीरे भंवर और 20 मिनट के लिए सेते पर 37 डिग्री सेल्सियस यह उसी या एक अलग प्रयोग में labelings स्वैप के क्रम में टी सेल प्रवास पर fluorophores के संभावित आंतरिक प्रभाव को बाहर करने की सिफारिश की है.
- ऊष्मायन के बाद, कमरे के तापमान पर 1-5 मिनट के लिए 1 FBS और सेते की मात्रा के साथ बुझाना है. गर्म पीबीएस के साथ 10 बार पतला और 300 जी में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र पूरा IMDM में पीबीएस और resuspend के साथ दो बार धोएं.
- आदर्श रूप में, प्रत्येक टी जनसंख्या का 10-20 x 10 6 कोशिकाओं एक 1:1 के अनुपात में मिश्रित किया जाना चाहिए और फिर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifuged. अंत में, गर्म पीबीएस के 200-250 एमएल में कोशिकाओं resuspend और पूंछ नस के माध्यम से इंजेक्षन.
- इंजेक्शन सेल निलंबन के 5-10 एमएल सटीक इनपुट अनुपात (आदर्श 1 के लिए करीब) की गणना करने के लिए बचाने के लिए और पीबीएस के 300 एमएल के साथ पतला FACS द्वारा विश्लेषण.
4. टी सेल का विश्लेषण घर वापस आना
हालांकि चूहों विभिन्न समय अंक (1 घंटे और कई दिनों के बाद टी सेल इंजेक्शन के बीच) पर विश्लेषण किया जा सकता है, आंत - रेखा टी कोशिकाओं के घर वापस आना 12-24 घंटे के बाद इंजेक्शन के बीच सबसे अच्छा प्रलेखित है. अब समय अंक अन्य अंतिम संख्या के अनुपात / जैसे सेल, टी सेल apoptosis और ऊतक से टी सेल से बाहर निकलें को प्रभावित चर के संभावित प्रभाव को बढ़ा सकते हैं. के बाद चूहों euthanized कई ऊतकों से, सेल निलंबन देरी के बिना अलग होना चाहिए क्रम में करने के लिए कोशिका मृत्यु में कमी कर रहे हैं, जो अंतिम पैदावार और परिणाम प्रभावित हो सकता है. हित के ऊतकों छोटी आंतों, बृहदान्त्र, प्लीहा, लिम्फ नोड्स, Peyer पैच, यकृत, फेफड़े और रक्त हैं. अगरइंजेक्शन टी कोशिकाओं सदाशयी आंत - रेखा टी कोशिकाओं रहे हैं, वे औसतन 5-10 बार बेहतर छोटी आंत mucosa के लिए (या अधिक) के रूप में टी कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में पर घर चाहिए. हालांकि, के रूप में अन्य ऊतकों, रक्त और तिल्ली, एक तरजीही टी सेल प्रवास प्रदर्शन नहीं करना चाहिए. आंतों लामिना propria और अंतःउपकला डिब्बे से लिम्फोसाइटों के अलगाव पहले 5 में वर्णित किया गया है.
- FACS धुंधला: नमूने कोशिकाओं की संख्या के आधार पर कोई 3.0 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल से अधिक घनत्व पर एकत्र resuspended हैं. यदि congenic CD45.1 + या Thy1.1 + चूहों प्राप्तकर्ताओं के रूप में इस्तेमाल किया गया, कोशिकाओं इसी congenic (उदाहरण के लिए, या Thy1.2 CD45.2) मार्कर कुछ वंश मार्कर (उदाहरण के लिए, TCRbchain, CD4, सीडी 8 के साथ संयुक्त के साथ दाग रहे हैं CD45.1 / CD45.2 + +).
- FACS विश्लेषण के दौरान, कोशिकाओं congenic मार्कर (CD45.1 उदाहरण के लिए) और फिर विशिष्ट वंश मार्करों (CD4/CD8 उदाहरण के लिए) पर gated और CMTMR और CFSE सकारात्मक कोशिकाओं के बीच अनुपात के लिए विश्लेषण कर रहे हैं.
- डेटा आमतौर पर घर वापस आना (HI) के सूचकांक है, जो अनुपात CFSE / इसी इनपुट अनुपात (नीचे देखें) से विभाजित प्रत्येक ऊतक में CMTMR (CMTMR / या CFSE) के रूप में गणना की है के रूप में व्यक्त किया है. यदि इनपुट अनुपात 1 के लिए बहुत करीब है, तो ऊतक अनुपात हाई के बराबर हो जाएगा.
हाई = CFSE / ऊतक CMTMR ऊतक: CFSE इनपुट इनपुट / CMTMR
रक्त भी क्रम में निर्धारित करने के लिए है कि दोनों टी सेल आबादी समान रूप से प्रचलन में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं या अगर एक टी सेल की आबादी दूसरे के सम्मान के (जैसे, फेफड़ों / जिगर में तरजीही फँसाने या कमी आई व्यवहार्यता द्वारा) की कमी हुई है विश्लेषण किया जाना चाहिए. यह जब भोले या आराम स्मृति टी कोशिकाओं की तुलना में हाल ही में सक्रिय effector टी कोशिकाओं की तुलना, क्योंकि बाद फेफड़ों में एक बड़ी हद तक फंसे हो सकते हो सकता है. यदि रक्त में हाई 1 से काफी अलग है, एक हाई ऊतकों में रक्त में हाई द्वारा मानक के अनुसार कर सकते हैं. रक्त anesthetized चूहों से हृदय पंचर AVERTIN या isofluorane पूर्व इच्छामृत्यु के साथ () के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है और ACK बफर के साथ दो बार यह FACS धुंधला का उपयोग करने के लिए से पहले lysed होना चाहिए.
रक्त सामान्य = हाई / ऊतक हाई ब्लड
5. प्रतिनिधि परिणाम
प्राप्तकर्ता चूहों (Thy1.1 +) euthanized18h पोस्ट सेल इंजेक्शन थे. सेल निलंबन तिल्ली, परिधीय लिम्फ नोड्स (PLN), mesenteric लिम्फ नोड्स (mln) और छोटी आंत लामिना propia (एल.पी.) से उत्पन्न किया गया. उसके बाद Thy1.2 और CD8 कोशिकाओं दाग थे और फिर व्यवहार्य Thy1.2 CD8 + + कोशिकाओं है, जो अंततः CMTMR + (आंत - रेखा टी कोशिकाओं) कोशिकाओं और CFSE के बीच का अनुपात के लिए विश्लेषण किया गया पर gating से FACS से विश्लेषण + इनपुट अनुपात से विभाजित कोशिकाओं (नियंत्रण टी कोशिकाओं). परिणाम प्रदर्शित किया जा के रूप में चित्रा 2, जिसमें यह सराहना की है कि आंत - रेखा और नियंत्रण टी कोशिकाओं तिल्ली (हाई to1 करीब है, एक लाल रेखा के साथ संकेत) के लिए भी उतना ही असर पड़ा में दिखाया गया है सकते हैं. इसके विपरीत करके, 10 गुना के आसपास आंत - रेखा टी कोशिकाओं और अधिक कुशलता से माइग्रेट एल.पी. के रूप में टी कोशिकाओं को नियंत्रित करने की तुलना में.
Figure1: पीढ़ी और पेट - रेखा और गैर - पेट रेखा टी कोशिकाओं की लेबलिंग टी कोशिकाओं दिखा आरेख जंगली प्रकार चूहों से अलग कर रहे हैं और anti-CD3/anti-CD28 के साथ और उपस्थिति या 100-200 एनएम के अभाव में सक्रिय - पार retinoic एसिड (आर ए). 4-5 दिनों के बाद आरए का इलाज टी सेल पेट घर वापस आना CCR9 और a4b7 रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति का अधिग्रहण. फिर, आंत - रेखा और नियंत्रण टी कोशिकाओं विभिन्न CFSE या CMTMR के साथ लेबल रहे हैं, धोया, एक 1:1 के अनुपात में मिलाया और पूंछ नस के माध्यम से एक प्राप्तकर्ता माउस में इंजेक्शन. कुछ लेबल कोशिकाओं को इनपुट / CFSE CMTMR अनुपात (1 करने के लिए बंद किया जाना चाहिए) का निर्धारण किया जाता है.
Figure2: घर वापस आना विश्लेषण का उदाहरण चूहे विश्लेषण 12-18 घंटे पोस्ट टी सेल इंजेक्शन और एकल कक्ष निलंबन हित के अंगों से प्राप्त कर रहे हैं. कोशिकाओं (congenic मार्कर) विरोधी Thy1.2 प्लस विरोधी CD8 और फिर Thy1.2 के साथ दाग रहे हैं CD8 + + टी कोशिकाओं CMTMR के अनुपात के लिए विश्लेषण कर रहे हैं + CFSE और + FACS द्वारा प्रत्येक ऊतक में कोशिकाओं. ऊतक / CMTMR CFSE अनुपात तो इनपुट अनुपात / CMTMR CFSE द्वारा सामान्यीकृत कर रहे हैं के लिए घर वापस आना सूचकांक (HI) के प्राप्त. इस उदाहरण CMTMR + और CFSE + कोशिकाओं पेट रेखा और नियंत्रण effector टी कोशिकाओं, क्रमशः रहे हैं.
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Discussion
हालांकि घर वापस आना प्रयोगों किसी भी ऊतक में कुल सेल आबादियों के प्रवास के बारे में बहुत ही मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इन assays सीधे endothelial आसंजन विश्लेषण नहीं करते हैं और इसलिए भेदभाव नहीं multistep आसंजन के जो कदम (नों) में झरना (tethering / सक्रियण, या चिपका रोलिंग) एक दिया घर वापस आना रिसेप्टर काम कर रहा है. सोने के लिए आसंजन झरना में घर वापस आना रिसेप्टर्स की विशिष्ट भूमिका को परिभाषित मानक intravital माइक्रोस्कोपी (IVM) में जो व्यक्ति fluorescently लेबल टी कोशिकाओं (या अन्य कक्षों या मोती भी fluorescently लेबल) वास्तविक समय में सीधे endothelial कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए मनाया जाता है. हालांकि, IVM समय लगता है, माउस संज्ञाहरण की आवश्यकता है श्रमसाध्य शल्यचिकित्सा की प्रक्रियाओं का तात्पर्य और लेबलिंग और इंजेक्शन के लिए शुद्ध और सजातीय सेल आबादी की बड़ी संख्या के पूर्व अलगाव की जरूरत है. इसके अलावा, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) सिस्टम और thymus जैसे कुछ ऊतकों, IVM के लिए उपयोग करने के लिए मुश्किल हैं. अंत में, IVM तैयारी ऊतक स्थिरीकरण है कि कुछ अंगों / ऊतकों जैसे यकृत, फेफड़े, और आंत (IVM पर एक विस्तृत चर्चा के लिए रेफरी देखने के 6.) में प्राप्त करने के लिए मुश्किल है की आवश्यकता होती है.
दूसरी ओर, घर वापस आना प्रयोगों अपेक्षाकृत आसान स्थापित करने के लिए कर रहे हैं, वे सह दो विभिन्न लेबल टी सेल आबादी इंजेक्शन द्वारा किया competitively कर सकते हैं, और वे FACS द्वारा एक ही प्रयोग में कई ऊतकों / अंगों और सेल आबादी के साथ - साथ परीक्षा की अनुमति . एक प्रतिस्पर्धी घर वापस आना प्रयोग में लक्ष्य निर्धारित करने के लिए एक टी सेल की आबादी विभिन्न ऊतकों में एक और (विभिन्न लेबल) टी सेल की आबादी के लिए सम्मान के रिश्तेदार प्रवास क्या है है. चूंकि परिणाम हाई के रूप में व्यक्त कर रहे हैं, विश्लेषण पूर्ण कोशिकाओं की गिनती की आवश्यकता नहीं होती और परिणाम इंजेक्शन टी कोशिकाओं की संख्या द्वारा प्रत्येक ऊतक में अलग / विश्लेषण टी कोशिकाओं की संख्या के द्वारा या जानवरों / अंगों में अंततः अंतर से प्रभावित नहीं कर रहे हैं, आकार.
इन फायदों के बावजूद, यह ध्यान में रखा होना चाहिए कि प्रतिस्पर्धी घर वापस आना प्रयोगों प्रत्येक ऊतक में टी सेल प्रवास की वास्तविक परिमाण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं. वास्तव में, हाय बहुत भ्रामक बहुत गरीब टी सेल प्रवास के साथ ऊतकों में और जिसमें से बहुत कुछ टी कोशिकाओं जैसे गैर सूजन बृहदान्त्र या सीएनएस में FACS, द्वारा पता लगाया जा सकता है किया जा सकता है (कुछ टी सेल घटनाओं है कि रक्त संदूषण का प्रतिनिधित्व हो सकता है सकते हैं हाई में भारी बदलाव में परिणाम). एक सामान्य नियम के रूप में, हाय इस्तेमाल किया जा केवल जब घटनाओं की पर्याप्त संख्या FACS, ताकि कम से कम लेबल टी सेल आबादी का एक स्पष्ट रूप से किसी दिए गए ऊतकों में indentified किया जा सकता है के द्वारा पता चला रहे हैं चाहिए.
अंत में, प्रतिस्पर्धी घर वापस आना प्रयोगों और HI गणना आदर्श टी कोशिकाओं (आमतौर पर प्रति 1 एक्स 10 कुल 6 इंजेक्शन टी कोशिकाओं के ऊतकों में टी कोशिकाओं की संख्या के रूप में व्यक्त) के पूर्ण सेल गिनती के साथ पूरित किया जाना चाहिए . हालांकि, प्रत्येक ऊतक में टी कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या का निर्धारण समय लेने और अपनी विश्वसनीयता / reproducibility सावधान इंजेक्शन तकनीक पर निर्भर करने के लिए विश्वास दिलाता हूं कि सबसे टी कोशिकाओं नसों के द्वारा और प्रत्येक ऊतक से कुशल टी सेल अलगाव पर इंजेक्ट कर रहे हैं.
संक्षेप में, हम आंत - रेखा और नियंत्रण टी कोशिकाओं के बीच प्रतिस्पर्धी घर वापस आना प्रयोगों का वर्णन है. हालांकि, इस पद्धति कई अन्य lymphoid कोशिकाओं (जैसे, अनुभवहीन या सक्रिय टी और बी कोशिकाओं, टी REG, आदि) और गैर lymphoid कोशिकाओं (जैसे, डीसी, स्टेम कोशिकाओं, आदि) के लिए भी लागू किया जा सकता है. इस प्रकार, घर वापस आना प्रयोगों vivo में सेल प्रवास के अध्ययन के लिए एक सरल, बहुमुखी और शक्तिशाली उपकरण प्रदान करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
EJV Crohn और बृहदांत्रशोथ फाउंडेशन अमेरिका के (CCFA) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है. JRM CCFA, कैंसर अनुसंधान संस्थान (CRI), हावर्ड एच. Goodman (MGH), मैसाचुसेट्स जीवन विज्ञान केंद्र (MLSC) और एनआईएच के निदेशक नई अन्वेषक पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित है.
Materials
| Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). | |||
| Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol. | |||
| ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature). | |||
| PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA). | |||
| Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case. | |||
| T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C. | |||
| Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies. | |||
| Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA). | |||
| All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA). |
References
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- Springer, T. A. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell. 76, 301-314 (1994).
- Iwata, M. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21, 527-538 (2004).
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