굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

Summary

경쟁 유도 실험 직접 하나의 마우스로 두 개의 서로 다른 세포 인구의 철새 속성을 평가하실 수 있습니다. 여기 우리는 전 생체내 생성 인내심 트로픽 대 비 직감 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 비교하여이 절차를 설명합니다.

Abstract

발휘하기 위해서는 자신의 기능 lymphocytes은 혈액을두고 신체의 다른 조직으로 마이 그 레이션해야합니다. 내피 세포 및 조직 넘쳐 흐름에 림프구 접착력이 lymphocytes과 내피 세포 ^{1 2에} 표시된 각각의 리간드 (addressins)에 표시 다른 접착 분자에 의해 통제 다단계 프로세스 (유도 수용체)입니다. 이러한 유착 수용체의 기능이 부분적으로 공부를 할 수 있지만 전 생체내 자신의 생리 관련에 대한 궁극적인 시험은 생체내 림프구 접착 및 마이 그 레이션에 동안 자신의 역할을 평가하는 것입니다. intravital 현미경 (IVM)과 유도 실험 : 두 개의 상호 보완적인 전략이 목적을 위해 사용되었습니다. IVM은 실시간으로 가능하고 다른 조직에 유착 폭포 중 특정 유착 수용체의 정확한 기여를 정의하는 필수되어 있지만, IVM은 집중 시간이 소요과 노동, 그것은 종종 정교한 수술 기법의 개발이 필요, 그것은 단일의 사전 격리 필요 세포 인구와 어떤 주어진 시간에 하나의 조직 / 기관의 분석을 수 있습니다. 반대로, 경쟁 유도 실험 같은 마우스의 두 마이 그 레이션 (혹은 이상) 셀 집합에 직접적이고 동시 비교를 허용하지 않으며 그들은 또한 많은 조직과 같은 실험에서 세포의 높은 숫자의 분석을 허용합니다.

여기서 우리는 제어 셀 인구에 비해 같은 특정 조직에 집으로 주어진 세포 유형의 장점 / 단점을 확인하는 데 사용되는 전통적인 경쟁 유도 프로토콜을 설명합니다. 창자 점막이 외부 환경과의 접촉에서 가장 큰 몸 표면이기 때문에 우리는 인내심을 트로픽 대 인내심 트로픽 비 T 세포의 철새 속성을 설명하기 위해 선택하고 또한 최고의 정의 철새 요구 사항을 추가 - 림프 조직이다 . 또한, 최근의 작품은 비타민이 신진 대사 모든 트랜스 retinoic 산 (RA)는 lymphocytes에 창자가 특정 유착 수용체 (인테 a4b7and의 케모카인 수용체 CCR9)를 유도에 대한 책임의 기본 분자 메커니즘 것을 확인했습니다. 따라서, 우리는 쉽게 드디어 여기에서 설명한 경쟁 유도 실험에서 사용할 수있는 각각 RA의 존재 또는 부재의 T 세포를 활성화하여 인내심을 트로픽 및 lymphocytes 인내심 트로픽 비 예 생체내 다수를 생성할 수 있습니다.

Protocol

인내심을 추적 및 제어 T 세포 1. 전의 생체내 생성 (그림 1 참조)

1. 야생 타입 마우스로부터 비장을 mashing하여 splenocytes를 분리. 5 '400 X G.에 대한 세포의 PBS의 서스펜션과 원심 분리기를 Resuspend 뜨는을 제거 후 2-3 분 동안 ACK 용해 완충액 4 ML에있는 세포 펠렛을 resuspending하여 적혈구를 lyse. 그 후, PBS 5 ML를 추가합니다. 5 '400 XG에 대한 원심 분리기 및 뜨는을 제거하십시오.
2. 1 총 splenocytes을 Resuspend X 10 ⁶ IMDM의 / ML + 10% FBS + 50 MM 2 - 메르 캅 토 에탄올 + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (완료 IMDM). 100-200 NM ³ 최종 농도 RA (또는 Am80 또는 Am580 같은 합성 RAR - agonists)와 보충 하나 중 두 그룹에서 세포를 분리. RA 또는 RAR - agonists의 면전에서 활성화된 T 세포가 a4b7and CCR9을 upregulate하고 RA 않고 활성화된 T 세포가 조절 T 세포가 될 반면, 인내심을 트로픽 T 세포가 될 것입니다.
3. 이전에 반대 인 경우에는 3 번 CD (10 MG / ML) 및 안티 CD28 (10 MG / ML)로 코팅 24 잘 접시의 각각 잘 수있는 세포 현탁액의 1.5-2.0 ML을 추가하고 37 품어 ° C를 5 % CO에 ₂ (코팅 접시 500 ML / 음의 안티 인 경우에는 3 번 CD 플러스 37에서 2 시간 동안 PBS과 부화에 안티 CD28을 추가 ˚ C 후 2 ML PBS로 두 번 세척).
4. T 세포 overstimulation을 방지하기 위해, 2-3 일 후에 새로운 uncoated 24 잘 접시에 세포 suspensions를 전송할 수 있습니다. 추가 2-3 일동안은 알을 품다. 세포 밀도와 확산에 따라 미디어는 신선한 완료 IMDM으로 미디어의 절반을 교체해야 할 수도있는 경우에 산성 (노란색)이 될 수도 있습니다. 4~5일 (일 0부터 계산) 후 세포를 수확.
5. 일반적인 최종 수확량은 X 10 ⁶ 효과기 T 세포 / 잘 1-2아르. 따라서, 각각의 인내심을 트로픽 T 세포 및 제어 T 세포의 9-12 웰스의 최소 조건 10-20 X 10 ⁶ T 세포와 최종하기 위해 도금한다.

2. 활성화된 T 세포에 대한 인내심을 유도 수용체 분석

문화 4~5일 후 우리는 통제 T 세포가 이러한 수용체 ⁴ 매우 낮은 수준을 표현한다 반면, RA 또는 RAR agonists의 면전에서 활성화된 T 세포에 대한 인내심을 유도 수용체 a4b7and CCR9 높은 표현을 준수해야합니다.

유동세포계측법 (외과) 분석.

1. 4 300g에서 5 분 0.2-0.5 X10 ⁶ 셀 및 원심 분리기 사이의 수집 ° C.
2. 4 15 분 ° 어둠 속에 C에 대한 안티 - CD4 - FITC, 안티 - a4b7 - PE (BD Biosciences), 안티 - CCR9 - APC (eBiosciences) 및 안티 - CD8 - PercP와 부화.
3. 부화 후, g 4 ° C. 300에서 5 분 원심 분리기 세척 및 resuspend 세포를 버퍼를 얼룩과 외과에 의해 분석할 수 있습니다.

3. CFSE 및 CMTMR 세포 추적기와 T 세포 라벨

1. 37 모든 솔루션을 보관 ° C를 시작하기 전에. 와시 직감을 트로픽 T 세포 (a4b7 ^높은 CCR9 ^하이) 및 제어 T 세포는 (a4b7 ^{낮은 / Neg} CCR9 ^{낮은 / Neg)} 두 번 PBS로 혈청을 제거합니다. 10-15 × 10 ⁶ / PBS에 ML하는 T 세포의 농도를 조정합니다.
2. 에서 부드럽게 와동 20 분 품어 각각 5 밀리미터 및 10 mm의 최종 농도 인내심 트로픽 T 및 제어 T 세포 중 하나에 CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl 에스테르) 또는 CMTMR (chloromethyl - 벤조일 - 아미노 tetramethylrhodamine) fluorophores 추가 37 ° C. 이것은 T 세포 이주에 fluorophores의 잠재적인 본질적인 영향을 제외하기 위해 동일 또는 별도의 실험에서 labelings를 교환하는 것이 좋습니다.
3. 부화 후, 상온에서 1-5 분 FBS와 부화 1 볼륨 끄다. 따뜻한 PBS로 10 배 희석 300 G.에서 5 분 원심 분리기 전체 IMDM의 PBS와 resuspend로 두 번 씻으십시오.
4. 이상적으로, 각 T 인구의 10-20 X 10 ⁶ 세포는 1:1 비율로 혼합 후 5 분 300 XG에 centrifuged해야합니다. 마지막으로, 따뜻한 PBS의 200-250 ML에있는 세포를 resuspend와 꼬리 정맥을 통해 주입.
5. 정확한 입력 비율 (1 이상을 닫습니다)를 계산하기 위해서는 주입 세포 현탁액의 50-10 ML을 저장하고 희석 PBS 300 ML과 외과하여 분석할 수 있습니다.

4. 유도 T 세포 분석

마우스가 다양한 시간 포인트 (1 H와 며칠 게시물 T 세포 주입 사이)에서 분석할 수 있지만, 인내심을 트로픽 T 세포의 유도는 최고의 12-24 H 포스트 분사 사이에 문서화되어있다. 긴 시간 포인트는 T 세포 apoptosis와 조직에서 T 세포 출구로 최종 휴대 전화 번호 / 비율을 영향을 미치는 다른 변수의 잠재 효과를 향상시킬 수 있습니다. 생쥐가 여러 조직에서 euthanized, 휴대 suspensions는 세포 죽음을 감소하기 위해 지체없이 격리되어야 후, 이것은 최종 산출 및 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 관심 조직은 소장, 대장, 비장, 림프절, Peyer의 패치, 간, 폐, 혈액 있습니다. 면주입 T 세포가 타고난 인내심 트로픽 T 세포 있으며, 그들은 T 세포를 제어에 비해 작은 창자의 점막에 평균 5-10 배 더 나은 (또는 이상)에서 가정해야합니다. 그러나, 혈액 및 비장 등의 조직은, 우선 T 세포의 마이 그 레이션을 전시 안됩니다. 창자 라미나의 propria 및 intraepithelial 구획에서 lymphocytes의 분리는 이전에 다음 ID로 ⁵ 설명했습니다.

1. 외과의 얼룩 : 샘플 3.0 X 10 ⁶ 세포 / ML 이상의 밀도에서 수집된 세포의 숫자에 따라 resuspended 있습니다. 경우 congenic CD45.1 ⁺ 또는 Thy1.1 ⁺ 마우스가받는 사람으로 사용되었다, 세포 일부 혈통 표시 (예, TCRbchain, CD4, CD8와 함께 해당 congenic 마커 (예 : CD45.2 또는 Thy1.2)에 묻은 게있다 , CD45.1 ⁺ / CD45.2 ^+).
2. 외과 분석하는 동안, 세포는 congenic 마커 (예 : CD45.1)에 다음 특정 혈통 표시 (예 : CD4/CD8)에 문이 및 CMTMR 및 CFSE 긍정적인 세포 사이의 비율에 대한 분석입니다.
3. 데이터는 일반적으로 해당 입력 비율 (아래 참조)으로 나눈 각 조직의 비율 CFSE / CMTMR (또는 CMTMR / CFSE)로 계산됩니다 호밍 지수 (HI)으로 표시됩니다. 입력 비율이 1 아주 가까이있다면, 조직 비율은 HI에 상응하는 것입니다.

HI = CFSE _조직 / CMTMR _조직 : CFSE _입력 / CMTMR _입력

혈액은 또한 모두 T 세포 인구가 균일하게 순환으로 표시됩니다 또는 한 T 세포 인구가 다른 경의를 (예, 폐 / 간에 우선 트래핑하거나 감소 생존 능력에 의해) 감소하는 경우 여부를 확인하기 위해 분석해야합니다. 후자가 폐에 더 큰 정도 갇혀있을 때문에, 순진하거나 쉬고​​있는 메모리 T 세포 대 최근 활성화 효과기 T 세포를 비교하면 이러한 문제가 발생할 수 있습니다. 혈액의 HI는 1보다 크게 다른 경우, 하나는 혈액에서 HI에 의해 조직에서 인사 정상화 수 있습니다. 혈액은 anesthetized 생쥐에서 심장 펑크 (avertin 또는 isofluorane 사전 안락사)를 통해 얻을 수 있으며, 외과의 얼룩을 위해 사용하기 전에 ACK 버퍼 번 lysed해야합니다.

혈액 정규화는 = HI _조직 / HI _블러드

5. 대표 결과

받는 마우스 (Thy1.1 ^+)는 euthanized18h 게시물 세포 주입했다. 셀 suspensions은 비장, 주변 림프절 (PLN), mesenteric 림프절 (MLN)과 소장의 라미나의 가끔하는 (LP)에서 생성되었습니다. 세포는 Thy1.2와 CD8을위한 스테인드 그리고 마지막 CMTMR ⁺ 세포 (인내심을 트로픽 T 세포)와 CFSE 사이의 비율에 대한 분석했다 가능한 Thy1.2 ⁺ CD8 ⁺ 세포에 게이팅로 외과에 의해 분석되었다 그 후 ⁺ 입력 비율로 나눈 전지 (제어 T 세포). 결과는 같은가 인내심을 트로픽 및 제어 T 세포가 균일하게 비장 (HI 빨간색 라인 표시, to1를 닫습니다)로 이동된 것을 감상할 수있는 그림 2와 같이 표시할 수 있습니다. T 세포를 제어에 비해 대조적으로, 인내심을 트로픽 T 세포는 LP에보다 효율적으로 10 번 주위를 마이 그 레이션.

Figure1 :. 창자 - 트로픽 및 비 직감 트로픽 T 세포의 생성 및 라벨을 보여주는 T 세포가 다이어그램은 야생 타입 마우스으로부터 격리 및 anti-CD3/anti-CD28과 100-200 nm의 존재 또는 부재 모두 활성화됩니다 - 트랜스 retinoic 산 (RA). 4~5일 후 RA - 취급 T 세포 수용체 용기를 유도 CCR9 및 a4b7의 표현을 획득. 그렇다면, 인내심을 트로픽 및 제어 T 세포는 differentially 1:1 비율로 혼합하여 꼬리 정맥을 통해받는 마우스에 주입, 씻어, CFSE 또는 CMTMR으로 표시됩니다. 일부 레이블이 세포는 CFSE / CMTMR 입력 비율 (종료 1한다)를 결정하는 데 사용됩니다.

Figure2 :. 돌입 분석의 예 마우스가 12-18 H 게시 T 세포 주입 및 단일 세포 suspensions가 관심의 기관에서 얻을 수있다 분석했다. 세포는 다음 방지 Thy1.2 (congenic 마커) 플러스 안티 - CD8 및 Thy1.2 물들일 아르 ⁺ CD8 ⁺ T 세포가 CMTMR의 비율에 대한 분석 아르 ^+와 CFSE ⁺ 외과 각 조직의 세포. 조직 CMTMR / CFSE 비율은 다음 위치 추적 색인 (HI)을 구하는 입력 CMTMR / CFSE 비율로 정상화됩니다. 이 예제 CMTMR의 ^+와 CFSE에 ⁺ 세포는 각각 직감 - 트로픽 및 제어 효과기 T 세포입니다.

Discussion

유도 실험 특정 조직에서 전체 세포 인구의 마이 그 레이션하는 것에 대한 매우 귀중한 정보를 제공하더라도, 그것은 이러한 assays 직접 내피 접착력을 분석하지 않으며 따라서 차별하지 않는 마음에 보관되어야하는 다단계 부착의 어느 단계 (S)에 캐스케이드 (tethering / 인증 또는 고집 롤링) 지정된 추적 수용체는 행동이다. 유착 층계에 들어가고 수용체의 특정 역할을 정의하는 황금 표준은 개별 찬란 표시된 T 세포 (또는 다른 셀 또는 찬란 표시 구슬) 직접 실시간으로 내피 세포와 상호 작용 관찰하는 intravital 현미경 (IVM)입니다. 그러나, IVM은 시간이 소요됩니다 마우스 마취가 필요합니다, 힘드는 수술 절차를 의미하고 라벨 및 사출에 대한 순수하고 균질 세포 인구의 다수의 사전 고립이 필요합니다. 또한, 같은 중추 신경계 (CNS)와 thymus 같은 일부 조직은 IVM에 대한 액세스하기 어렵습니다. 마지막으로, IVM 준비는 간, 폐, 대장 같은 일부 기관 / 조직 (IVM에 대한 자세한 논의에 대한 심판을 참조하십시오. ^6)에서 달성하기 어려운 조직 고정을 필요로합니다.

반면에, 누군가에게 실험 설정 상대적으로 쉽게, 그들은 두 differentially 표시 T 세포 인구를 공동 주사하여 경쟁력 완료, 그들은 외과로 한 실험에 여러 조직 / 장기 및 세포 인구의 동시 검사를 허용 수 있습니다 . 경쟁 유도 실험에서 목표는 서로 다른 조직에서 다른 (differentially 표시) T 세포 인구 하나의 T 세포 인구 존중의 상대적인 마이 그 레이션이 무엇인지 결정하는 것입니다. 결과가 HI로 표현되기 때문에, 분석은 절대 셀 계산을 필요로하지 않으며 그 결과는 각 조직의 절연 / 분석 T 세포의 숫자 또는 동물 / 장기 결국 차이에 의해 주입 T 세포의 숫자에 의해 영향을받지 않습니다 크기.

이러한 장점에도 불구하고, 그것은 경쟁 유도 실험은 각 조직으로 T 세포의 마이 그 레이션의 실제 크기에 대한 정보를 제공하지 않는 것이 마음에 보관해야합니다. 사실, HI 매우 가난한 T 세포 이주와 조직과 거의 T 세포가 같은 비 염증 콜론이나 CNS 같이 외과에 의해 감지 수있는 매우 오해 수 있습니다 (혈액 오염을 나타내는 것 몇 가지 T 세포 이벤트 수 ) HI의 거대한 변화의 결과. 일반적으로, HI는 이벤트 충분한 숫자가 표시된 T 세포 인구 중 적어도 하나가 명확하게 특정 조직에 indentified 수 있도록 외과에 의해 감지하는 경우에만 사용해야합니다.

마지막으로, 경쟁 유도 실험과 HI 계산이 이상적으로 T 세포 (보통 1 X 10 ⁶ 총 주입 T 세포 당 조직에서 T 세포의 숫자로 표현)의 계산 절대 셀을 구비해야합니다. 그러나 각 조직에서 T 세포의 절대 숫자를 결정하는 것은 시간이 소요 및 신뢰성 / 재현성은 대부분의 T 세포 정맥 각 조직의 효율적인 T 세포 격리에 주사 보장하기 위해주의 사출 기술에 의존하게됩니다.

요약, 우리는 인내심을 트로픽 및 제어 T 세포 사이의 경쟁 유도 실험을 설명합니다. 그러나이 방법은 다른 많은 림프 세포 (예, 순진하거나 활성화 T와 B 세포, T _REG 등) 또한 비 림프 세포 (예, DC, 줄기 세포 등)에 적용할 수 있습니다. 따라서, 유도 실험은 생체내 세포의 마이 그 레이션을 연구하기 위해, 간단한 다목적하고 강력한 도구를 제공합니다.

Materials

Animals: C57BL/6mice are commonly used for T cell isolation. In addition, CD45.1 and Thy1.1 congenic strains are available through Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME).

Culture media: IMDM (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium + L-Glutamine + Hepes) plus 10% heat-inactivated FBS (Fetal Bovine Serum, low endotoxin, Gibco®, Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 100 U/ml penicillin, 100 mg/ml streptomycin (HyClone Antibiotics, Waltham, MA), 0.5 mg/ml fungizone/amphotericin B (Gibco), and 50 mM b-mercapt–thanol.

ACK Red Blood Cell Lysis buffer(RBC, 10 mM KHCO3, 150 mM NH4Cl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0), adjust to pH 7.2-7.4 and store at room temperature).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Flow cytometry (FACS) media(PBS or IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). When staining using Selectin-Fc chimeras, media with 2 mM Ca++ should be used in all steps (including FACS acquisition). IMDM is recommended in this case.

T cell labeling and adoptive transfer: CFSE(carboxyfluorescein diacetate, succinimidyl ester), CMTMR ((5-(and-6)-(((4-chloromethyl)benzoyl)amino) tetramethylrhodamine) from Molecular Probes®, Invitrogen, Carlsbad, CA). 1000 x stocks should be made in DMSO (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) and stored at -20°C.

Polyclonal T cell activation: 24-well or 96-well plates (tissue-culture treated, polystyrene, flat-bottom with lid, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) are incubated for 2 hours at 37°C with 50 ml PBS, respectively, containing anti-CD3 plus anti-CD28 antibodies (10 mg/mL each). Then, culture plates are washed twice with PBS and used immediately for T cell culture. Alternatively, Dynabeads coated with anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) can be used for T cell activation instead of plate-bound antibodies.

Flow cytometry (FACS) staining: Polyclonal activation: CD3 (1452C11), CD28 (37.51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-homing receptors: purified CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7(LPAM-1/DATK3), isotype control (IgG2a, k). Skin-homing receptors: P-selectin-Fc (Purified Mouse P-Selectin - IgG Fusion Protein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-selectin-Fc (Recombinant Mouse E-Selectin/Fc Chimera, R&D Systems, Minneapolis, MN) plus corresponding secondary reagent goat F(ab’)2 anti-human IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans retinoic acid(Sigma, St. Louis, MO)is resuspended in absolute ethanol or DMSO using a yellow bulb or an indirect source of light during the preparation. Store aliquots in glass vials at -80°C and protected from light at all times. Synthetic RAR-agonists: Am80(Wako Chemicals, Richmond, VA).