Fabbricazione di un dispositivo a microfluidi per la compartimentazione dei Neuron Soma e assoni

Summary

In questo video ci mostrano la tecnica della litografia soft con polidimetil silossano (PDMS) che usiamo per farbricate un dispositivo a microfluidi per i neuroni di coltura.

Abstract

In questo video, dimostriamo la tecnica della litografia soft con polidimetil silossano (PDMS) che usiamo per fabbricare un dispositivo a microfluidi per i neuroni di coltura. In precedenza, un wafer di silicio è stato modellato con la progettazione del dispositivo neurone microfluidica utilizzando SU-8 e fotolitografia per creare uno stampo maestro, o che cosa ci riferiamo semplicemente come un "master". Successivamente, versate il silicio polimero PDMS in cima al maestro che viene poi curata dal riscaldamento del PDMS a 80 ° C per 1 ora. Il PDMS forma uno stampo negativo del dispositivo. Il PDMS è poi accuratamente tagliata e sollevata dal maestro. I buchi sono forati in cui i serbatoi saranno e l'eccesso PDMS tagliato fuori dal dispositivo. L'azoto è usato per soffiare via i detriti in eccesso dal dispositivo. A questo punto i dispositivi sono ora pronti per l'uso e può legato a corning n ° 1 bicchiere coprire con un plasma sterilizzatore / pulitore o può essere reversibile legata al vetro di copertura, semplicemente posizionando il dispositivo sulla parte superiore del vetro di copertura. Il legame reversibile del dispositivo al vetro è coperto in un altro video e richiede prima che il dispositivo da sterilizzare sia con il 70% di etanolo o in autoclave. Plasma trattamento sterilizza i dispositivi in ​​modo che nessun ulteriore trattamento è necessario. E 'tuttavia importante, quando plasma trattamento dei dispositivi, per aggiungere liquido al dispositivo entro 10 minuti di trattamento al plasma, mentre le superfici sono ancora idrofile. In attesa più lunghi di 10 minuti per aggiungere liquido al dispositivo rende difficile per il liquido di entrare nel dispositivo. I dispositivi sono in genere neurone plasma legato alla copertura in vetro e 0,5 mg / ml di poli-L-lisina (PLL) a pH 8,5 tampone borato è immediatamente aggiunto al dispositivo. Dopo un minimo di 3 ore di incubazione con PLL, i dispositivi vengono lavati con acqua dH2O un minimo di 3 volte con almeno 15 minuti tra ogni lavaggio. Successivamente, l'acqua viene rimossa e mezzi freschi si aggiunge al dispositivo. A questo punto il dispositivo è pronto per l'uso. E 'importante ricordare, a questo punto per rimuovere mai tutti i media dal dispositivo. Lasciare sempre i media nel canale principale.

Protocol

Parte 1: Preparazione del dispositivo a microfluidi neurone

1. A 3 "wafer di silicio con un modello fatto di SU-8 di fotolitografia è utilizzata per lanciare l'(PDMS) Polidimetilsilossano stampo microfluidica. Ci riferiamo al SU-8 wafer di silicio modellata come stampi master o" maestri ".
2. PDMS è mescolato con catalizzatore nel p / w rapporto di 10:1, cioè per 10 grammi di PDMS, 1 grammo di catalizzatore è aggiunto ad esso.
3. Il PDMS è poi mescolato bene e versato sul wafer di silicio. Il wafer di silicio è contenuto in un piatto di polistirolo 10 centimetri di Petri. Ci vogliono circa 12 g per 15 g di PDMS per coprire il master con uno spessore di circa 4 mm.
4. Il master con il PDMS viene poi posto in un essiccatore a vuoto con il coperchio della scatola di Petri, e pompa a vuoto. Questo viene fatto per aiutare a rimuovere le bolle d'aria dal PDMS che sono state introdotte durante l'agitazione in del catalizzatore. Ci vogliono circa 15 minuti per le bolle d'aria da rimuovere.
5. Il master con PDMS viene rimosso dal essiccatore. Un fucile ad aria con un filtro da 0,45 um viene utilizzato per rimuovere eventuali bolle rimanenti.
6. Il master è quindi posto su una piastra di 80 ° C a caldo per 1 ora da curare.

Nota: se un essiccatore a vuoto non è disponibile, il master può essere lasciato a temperatura ambiente per diverse ore. Le bolle d'aria alla fine dissipare per conto proprio. Se un piatto caldo non è disponibile, il PDMS curerà a temperatura ambiente dopo 24 ore.

Nota: E 'anche importante assicurarsi che il master sia in piano durante il processo di polimerizzazione.

Parte 2: Taglio del dispositivo neurone microfluidi

1. Una volta che il PDMS è curata sul master, che viene portato in una cappa pulita.
2. Utilizzando una lama chirurgica, un cerchio è tagliato intorno al perimetro dei dispositivi. Quando si inserisce la lama nel PDMS, è importante prendere contatto con il wafer di silicio, ma non mettere troppa pressione sul wafer, altrimenti il ​​padrone si spezzerà.
3. Con un cerchio tagliare tutto il modo per aggirare i dispositivi (ci sono 4 dispositivi per ogni "3 Master Silicio), il PDMS è alzato attentamente fuori il padrone. Questo può essere avviato da torcere delicatamente la lama chirurgica in quanto è inserito nel sezionate prima .
4. Successivamente, i serbatoi sono forati nel dispositivo utilizzando un 8 mm biopsia punch.
5. I dispositivi sono poi squartato e tagliato via l'eccesso PDMS in modo che il dispositivo si adatta perfettamente a Corning coperchio di vetro (n. 1) 24 mm x 40 mm. L'azoto dell'aria è usato per soffiare via tutti i detriti in eccesso. Detriti testardo può anche essere rimosso utilizzando Marca 3M Scotch 471 nastro in vinile.

Parte 3: Plasma incollaggio i dispositivi scivola copertura in vetro.

1. Cleaner plasma viene utilizzato per legare un Harrick i dispositivi neurone al coprioggetto. In breve, i dispositivi vengono inseriti nella pulizia al plasma e una pompa da vuoto è utilizzato per evacuare l'aria dalla camera.
2. Dopo la pressione di vuoto ha raggiunto 300 milliTorr, si accende la bobina elettrica e impostato su alto.
3. La bobina elettrica crea plasma ", un gas parzialmente ionizzato costituito da elettroni, gli ioni e atomi neutri o molecole" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , fuori le molecole di aria residua nella camera di sinistra. Il plasma crea specie reattive sulle superfici del vetro e del dispositivo, che una volta messi insieme formeranno un legame permanente. Il plasma si trasforma anche le superfici idrofile, che aiuta a facilitare l'aggiunta di liquidi. Inoltre, il dispositivo di pulizia al plasma sterilizza i dispositivi.
   
   La superficie del dispositivo PDMS che contiene il dispositivo a microfluidi è posizionato rivolto verso il filtro al plasma con le diapositive di vetro.
   
   Le superfici trattate al plasma del vetro e dispositivo a microfluidi sono assemblati in contatto con l'altro in un banco pulito, poi messo in sterili 60 piatti mm. Le superfici trattate formare un legame stretto irreversibile.
   
4. Entro 10 minuti di plasma incollaggio dei dispositivi al vetro, Poli-L-lisina (PLL) viene aggiunto al dispositivo. Dopo 10 minuti, l'idrofilia del dispositivo diminuisce rendendo difficile per il PLL per entrare nel dispositivo.
   
   Nota: è importante verificare la presenza di bolle d'aria nel dispositivo dopo l'aggiunta di PLL. Le bolle d'aria nel canale principale sono indesiderabili, come farebbero ossidare le cellule. Un metodo semplice per rimuovere eventuali bolle d'aria esistente è quello di utilizzare una pipetta P200 riempito con 150 ul di liquido (in questo caso PLL), posizionare la punta direttamente all'apertura del canale principale, e premere il P200 con forza. Questo può essere necessario ripetere più volte ma alla fine la forza dalla pipetta guiderà le bolle fuori.
   
   
5. I dispositivi contenenti PLL sono autorizzati a incubare una notte in una cultura incubatore standard di tessuto a 37 ° C con 5% di CO _2.
6. Il giorno successivo, devizi sono sciacquate due volte rapidamente con autoclave dH2O. Durante questo processo, il liquido non è mai completamente rimossa dai canali principali, solo dai serbatoi. La rimozione di liquido dai canali principali introdurrà bolle. Dopo 2 risciacqui veloci, i dispositivi sono pieni di autoclave dH2O e reinserito nella incubatore per un minimo di 3 ore, o durante la notte.
7. Il giorno dopo, i dispositivi sono ancora una volta risciacquati 2 volte rapidamente con autoclave dH2O. Poi, neurali dei media basale, contenente le integrazioni necessarie B27 e glutamax per i neuroni di ratto coltura principale, si aggiunge ai dispositivi. I dispositivi sono rimesse in incubatrice per un uso futuro. I dispositivi sono ora pronti per la semina dei neuroni.

Discussion

In questo video abbiamo dimostrato come fare e preparare un dispositivo PDMS microfluidi che usiamo per i neuroni cultura in Il dispositivo permette di ottenere una frazione pura assonale separati da microscolpiture dal vano contenente un mix di corpi cellulari, dendriti e degli assoni . Questi dispositivi consentono al ricercatore di studiare gli effetti dei vari trattamenti, oltre a fornire una piattaforma per effettuare danni fisici allo assoni e osservare quello che questi trattamenti hanno effetti sui neuroni. Il dispositivo fornisce anche un livello di coltura per i neuroni che aiuta a facilitare gli studi di trasporto. Inoltre, il microscolpiture, che separano il vano di coltura cellulare dal vano assone, permette di isolamento fluido tra i due comparti che rende possibile il trattamento di un lato del dispositivo senza influenzare l'altro lato del dispositivo direttamente con il trattamento. Questa proprietà consente al ricercatore di studiare gli effetti come la trasduzione del segnale e dei trasporti che risultano dal trattamento.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	Reagent	Dow Corning		Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you
Plasam Cleaner	Tool	Harrick Scientific Products, Inc.		http://www.harrickplasma.com/
Neural Basal Media	Reagent	Invitrogen	21103-049	Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
B27	Reagent	Invitrogen	17504-044	B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents.
Glutamax	Reagent	Invitrogen	35050-061	Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents.
Cornig No. 1 Cover Glass	cover glass	Corning	Corning No. X2935 244	Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D
60 mm Petri Dish	Tool	Fisher Scientific	08-757-13A	60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass.
BD Falcon 50 ml Tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352098	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A
BD Falcon 15 ml tube	Tool	BD Biosciences	Falcon No. 352097	Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C
Poly-L-Lysine	Reagent	Sigma-Aldrich	P-1274
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