Summary
В этом видео мы продемонстрируем технику мягкой литографии с полидиметилсилоксан (PDMS), который мы используем, чтобы farbricate микрожидкостных устройство для культивирования нейронов.
Abstract
В этом видео мы продемонстрируем технику мягкой литографии с полидиметилсилоксан (PDMS), который мы используем для изготовления микрожидкостных устройство для культивирования нейронов. Ранее кремниевой пластины был скопирован с дизайна для нейрона микрожидкостных устройства с помощью SU-8 и фотолитографии для создания мастер плесенью, или то, что мы просто называем "мастер". Далее, мы наливаем кремний полимера PDMS в верхней части мастер, который затем вылечить путем нагревания PDMS до 80 ° С в течение 1 часа. PDMS формы отрицательные формы работы устройства. PDMS Затем аккуратно надрезать и поднял от хозяина. Пробивают отверстия, где водохранилища будет, и избыток PDMS обрезается от устройства. Азот используется для сдуть лишнюю мусор из устройства. На данный момент устройства в настоящее время готова к использованию и может либо связан с Corning № 1 покровного стекла с плазмой стерилизатор / очиститель или может быть обратимо связаны с защитным стеклом, просто поместив устройство в верхней части покровного стекла. Обратимое связывание устройств к стеклу рассматривается в отдельном видео и требует сначала, что устройство можно стерилизовать или с 70% этанола или автоклавированием. Плазменной обработки стерилизует устройства таким образом, без дальнейшего лечения не требуется. Это, однако, важно, когда плазменной обработки устройств, добавить жидкость устройства в течение 10 минут плазменной обработки поверхности, в то время как все еще гидрофильными. Ожидание более 10 минут, чтобы добавить жидкость устройства делает его трудным для жидкости внутрь устройства. Нейрона устройств, как правило, плазменные обязаны покровного стекла и 0,5 мг / мл поли-L-лизин (PLL) рН 8,5 боратном буфере будет сразу же добавлен к устройству. После не менее 3 часов инкубации с PLL, устройств промывают водой dH2O минимум 3 раза в течение 15 минут между каждым стирки. Затем вода удаляется и свежие СМИ добавляют устройству. На данный момент устройство готово к использованию. Важно помнить, в этот момент, чтобы никогда не удалить все средства массовой информации с устройства. Всегда оставляйте средств массовой информации в основном канале.
Protocol
Часть 1: Подготовка микрожидкостных устройств нейрона
- 3 "кремниевой пластины с шаблона из SU-8 с помощью фотолитографии используется для литых Полидиметилсилоксан (PDMS) микрожидкостных плесени. Мы ссылаемся на СУ-8 узорной кремниевой пластины как мастер формы, или" мастеров ".
- PDMS смешивается с отвердителем в AW / W соотношении 10:1, то есть на 10 граммов PDMS, 1 грамм отвердителя добавляется к нему.
- PDMS затем перемешивают и выливают на кремниевой пластине. Кремниевой пластины находится в пределах 10 см блюдо полистирола Петри. Она занимает около 12 г до 15 г PDMS для покрытия мастер с толщиной около 4 мм.
- Мастер с PDMS затем помещается в вакуум эксикаторе с крышку чашки Петри, и вакуум применяется. Это делается, чтобы помочь удалить пузырьки воздуха из PDMS, которые были введены во время перемешивания в из отвердителя. Она занимает около 15 минут для пузырьки воздуха должны быть удалены.
- Мастер с PDMS удаляется из эксикаторе. Пневматический пистолет с 0,45 мкм фильтр используется для удаления оставшихся пузырьков.
- Мастера помещается на 80 ° C плитке в течение 1 часа, чтобы вылечить.
Примечание: Если вакуум эксикаторе не доступна, мастера можно оставить при комнатной температуре в течение нескольких часов. Пузырьков воздуха в конце концов рассеивается по себе. Если плитка не доступен, PDMS вылечит при комнатной температуре через 24 часа.
Примечание: Важно также, чтобы убедиться, что мастер уровне во время процесса вулканизации.
Часть 2: вырезать устройство нейрона микрожидкостных
- После PDMS лечится от хозяина, он берется чистый капот.
- Использование хирургического лезвия, круг разрезают по периметру устройства. Когда один вставками лезвие в PDMS, важно установить контакт с кремниевой пластины, но не ставить слишком много давления на пластину, иначе мастер трещины.
- С круга вырезаны все наоборот устройств (Есть 4 устройств на каждые 3 "Мастер Silicon), PDMS тщательно снят мастером. Это может быть запущен, осторожно поворачивая хирургического ножа, как оно вставляется в предварительное сокращение .
- Далее, резервуаров пробиваются в устройство с помощью 8 мм биопсии удар.
- Устройства затем четвертовали и избыток PDMS обрезается так далеко, что устройство будет вписываются в Corning покровного стекла (№ 1) 24 мм х 40 мм. Азот используется воздух, чтобы сдуть лишнюю мусора. Упрямый мусор может также быть удалены с помощью 3M Scotch марка 471 виниловой лентой.
Часть 3: плазменные связи устройств скользит стеклянной крышкой.
- Плазменные чистого используется для связи Harrick нейрона устройства к крышке скользит. Короче говоря, устройства помещаются в плазме более чистым и вакуумный насос, используемый для откачивания воздуха из камеры.
- После вакуума достигла 300 milliTorr, питание включено в электрическую катушку и на высокий.
- Электрическая катушка создает плазму, "частично ионизированный газ, состоящий из электронов, ионов и нейтральных атомов или молекул" - http://www.harrickplasma.com/plasma_physics.php , из остальных молекул воздуха остается в камере. Плазмы создает активные формы на поверхности стекла и устройства, которые при помещении вместе сформируют постоянную связь. Плазме также оказывается поверхности гидрофильные, который помогает облегчить добавление жидкостей. Кроме того, плазма чистого стерилизует устройств.
Поверхность устройства PDMS, который содержит микрожидкостных устройство помещается лицевой стороной вверх в плазме наряду с чистого стеклах.
Плазмы обработанных поверхностей из стекла и микрожидкостных устройства монтируются в контакте друг с другом на чистом столе, затем помещают в стерильный 60 блюд мм. Обработанные поверхности формы плотно необратимым облигаций. - В течение 10 минут плазмы связи устройств для стекла, поли-L-лизин (PLL) добавляется к устройству. Через 10 минут гидрофильность устройство будет уменьшаться что делает его трудным для PLL, чтобы войти в устройство.
Примечание: Важно, чтобы проверить пузырьков воздуха в устройстве после добавления PLL. Пузырьки воздуха в основной канал нежелательны, поскольку они будут окисляться клеток. Легкий метод, чтобы удалить все существующие пузырьки воздуха является использование P200 пипетки заполнены на 150 мкл жидкости (в данном случае PLL), место наконечника непосредственно на открытии главный канал, и тем самым обесценить P200 сильно. Это, возможно, придется повторить несколько раз, но в конечном итоге силу с пипеткой будет управлять пузырьки. - Устройства, содержащие PLL разрешено инкубировать в течение ночи в стандартном культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° C с 5% CO 2.
- На следующий день, де-пороки промывать два раза подряд с автоклавного dH2O. В ходе этого процесса жидкость никогда полностью не удаляются из основных каналов, только из резервуаров. Удаление жидкости из основных каналов представит пузыри. После 2-х быстро полосканий, устройства заполнены автоклавного dH2O и поместили обратно в инкубаторе в течение минимум 3 часа, или на ночь.
- На следующий день, устройства вновь промывают в 2 раза быстрее с автоклавного dH2O. Затем, нейронные базальной средах, содержащих необходимые добавки B27 и glutamax для культивирования первичных нейронов крысы, добавляется к устройствам. Устройства помещены обратно в инкубатор для использования в будущем. Устройства в настоящее время готовы к посевной нейронов.
Discussion
В этом видео мы показали, как сделать и подготовить устройство PDMS микрожидкостных которые мы используем для культуры нейронов дюйма устройство позволяет получить чистое аксонального фракция разделенных микродорожек из отсека, содержащего смесь клеточного тела, дендритов и аксонов . Эти устройства позволяют исследователю для изучения влияния различных методов лечения, а также предоставить платформу для проведения физических повреждений на аксоны и наблюдать, какие последствия эти процедуры оказывают на нейроны. Устройство также обеспечивает уровень для культивирования нейронов, которые помогают облегчить транспортных исследований. Кроме того, микродорожек, которые отделяют купе культуре клеток из аксонов отсеке, позволяет жидкостный изоляции между двумя отсеками делает его можно лечить одной стороне устройства, не влияющие другой стороне устройства непосредственно с лечением. Это свойство позволяет исследователю изучать эффекты, такие как сигнальные и транспортные, что в результате лечения.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | Reagent | Dow Corning | Sylgard 184 with curing agentPlease consult Dow Corning to find a vendor near you | |
| Plasam Cleaner | Tool | Harrick Scientific Products, Inc. | http://www.harrickplasma.com/ | |
| Neural Basal Media | Reagent | Invitrogen | 21103-049 | Neural Basal Media is obtained by Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| B27 | Reagent | Invitrogen | 17504-044 | B27 is a proprietary supplement available through Invitrogen under their Gibco line of cell culture reagents. |
| Glutamax | Reagent | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax is available through Invitrogen under their Gibco line of celll culture reagents. |
| Cornig No. 1 Cover Glass | cover glass | Corning | Corning No. X2935 244 | Available through Fisher Scientific, Fish Catalog number 12-531D |
| 60 mm Petri Dish | Tool | Fisher Scientific | 08-757-13A | 60 mm polystyrene sterile petri dishes are used to house the device bound to glass. |
| BD Falcon 50 ml Tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-49A |
| BD Falcon 15 ml tube | Tool | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | Available through Fisher Scientific catalog number 14-959-70C |
| Poly-L-Lysine | Reagent | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| New Item |
References
- Park, J. W., Vahidi, B., , A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
