मानव तंत्रिका स्टेम सेल की गिनती

Summary

कई टिशू कल्चर जोड़तोड़ के लिए व्यवहार्य कोशिकाओं की सही संख्या का ज्ञान आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कैसे रहते हैं और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए और एक hemacytometer का उपयोग कर कक्षों यों. हालांकि यह मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) की गिनती का वर्णन है, यह अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Immunocytochemistry के लिए या सेल transfections के लिए चढ़ाना कोशिकाओं के रूप में कई नियमित टिशू कल्चर जोड़तोड़, के लिए एक सेल निलंबन की एक निश्चित मात्रा में व्यवहार्य कोशिकाओं की सही संख्या का ज्ञान आवश्यक है. इस प्रोटोकॉल रहते हैं और मृत कोशिकाओं और सेल एकाग्रता और कुल सेल एक hemacytometer का उपयोग कर संख्या बढ़ाता के बीच फर्क करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि का वर्णन करता है. यह प्रक्रिया पहली बार एक वृद्धि की सतह से कोशिकाओं और उन्हें मीडिया में resuspending detaching की आवश्यकता है. अगला, कोशिकाओं Trypan नीला (एक एकाग्रता है कि वृत्त का चतुर्थ भाग प्रति 20-50 कोशिकाओं देंगे आदर्श) के एक समाधान में पतला कर रहे हैं और hemacytometer में रखा. अंत में, कई बेतरतीब ढंग से चुनी गई quadrants में व्यवहार्य कोशिकाओं के औसत मायने रखता है, एक 1 मिमी ² (0.1 μl) वृत्त का चतुर्थ भाग और कमजोर पड़ने कारक से गुणा की मात्रा से विभाजित औसत एल प्रति कोशिकाओं की संख्या देता है Μl में कुल मात्रा द्वारा इस सेल एकाग्रता गुणा कुल सेल नंबर देता है. इस प्रोटोकॉल मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) की गिनती का वर्णन है, लेकिन यह भी कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं passaging

नोट: कृपया को देखें passaging मानव तंत्रिका स्टेम सेल और कैसे अलग करने के लिए कोशिकाओं resuspend पर आलेख. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

गिनती के लिए सेल सस्पेंशन की तैयारी

1. 0.4% Trypan ब्लू समाधान और एक Eppendorf ट्यूब में 20 μl सेल मीडिया के प्लेस के 25 μl.
2. धीरे से मीडिया के एक ज्ञात मात्रा में कोशिकाओं युक्त ट्यूब के लिए एक समरूप निलंबन बनाने के दोहन के द्वारा गिना जा कोशिकाओं Resuspend. Eppendorf ट्यूब से पिछले चरण में कोशिकाओं के 5 μl रखें. यह कदम 10 के एक पहलू द्वारा सेल एकाग्रता dilutes.
3. Hemacytometer कवर पर कांच प्लेस, और सेल निलंबन के 11-12 μl बारे में लोड.
   
   
   
   

Hemacytometer में कक्ष गिनती

1. एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप में hemacytometer के पूरे ग्रिड निरीक्षण. ग्रिड के एक वृत्त का चतुर्थ भाग (जैसे लाल रंग में एक) पर ध्यान दें.
   
   
   
   
2. मृत या मर कोशिकाओं नीला दिखाई देती हैं क्योंकि उनके झिल्ली क्षतिग्रस्त हो गया है और Trypan नीले डाई बाहर करने में सक्षम नहीं हैं जाएगा. व्यवहार्य कोशिकाओं नीले नहीं दिखाई और चरण विपरीत में प्रकाश की एक "प्रभामंडल" ("चरण उज्ज्वल होगा") से घिरा हो जाएगा.
3. एक वृत्त का चतुर्थ भाग (क्षेत्र 1 ² मिमी) में व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या की गणना . तुम भी कोशिकाओं की कुल संख्या से व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को विभाजित करके सेल व्यवहार्यता का निर्धारण कर सकते हैं. 3-4 यादृच्छिक quadrants में कक्षों की गणना और वृत्त का चतुर्थ भाग प्रति कोशिकाओं की औसत संख्या निर्धारित है. के बाद से एक वृत्त का चतुर्थ भाग की मात्रा को 10 ^-4 मिलीलीटर या 0.1 μl हो जाता है, कोशिकाओं की एकाग्रता का निर्धारण किया जा सकता है
   
   
   
   
   
   
4. आप निम्न शॉर्टकट का उपयोग करने के लिए # कोशिकाओं / μl निर्धारित कर सकते हैं:
   
   
   
   # ट्यूब में कोशिकाओं की कुल = # कोशिकाओं / μl एक्स ट्यूब में μl

Discussion

यह एक सरल और तेजी से कोशिकाओं शामिल प्रयोगों की एक किस्म के लिए सेल एकाग्रता का निर्धारण करने के प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. 3 डी में वर्णित शॉर्टकट का उपयोग करना, एक जल्दी और सही सेल एकाग्रता और एक निश्चित मात्रा में कुल सेल नंबर निर्धारित कर सकते हैं.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Phase Contrast Hemacytometer	Tool	Hausser Scientific	02-671-54	Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4%	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15250-061	Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #