Summary
가능한 세포의 정확한 수를 지식은 많은 조직 문화 조작이 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 hemacytometer를 사용하여 세포를 계량하는 방법에 대해 설명합니다. 그것이 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명하지만, 그것은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.
Abstract
세포 현탁액의 주어진 볼륨에서 가능한 세포의 정확한 개수의 지식은 이러한 immunocytochemistry 또는 셀 transfections에 대한 도금 세포 많은 일상적인 조직 문화의 조작을 위해 필요합니다. 이 프로토콜은 살고 죽은 세포 사이의 차별과 세포 농도와 hemacytometer를 사용하여 전체 휴대폰 번호를 quantifying 위해 간단하고 빠른 방법을 설명합니다. 이 절차는 먼저 성장 표면에서 세포를 분리 및 미디어에서 그들을 resuspending 필요합니다. 다음, 전지 Trypan 파랑 (이상 사분면마다 20-50 세포를 줄 수있는 농도)의 용액에 희석하여 hemacytometer에 배치됩니다. 마지막으로, 한 1mm 2 사분면 (0.1 μl)와 희석 계수 곱한의 볼륨에 의해 평균 나누어 여러 무작위로 선택된 quadrants에서 가능한 세포의 수를 평균하면 나도 당 세포의 숫자를 제공합니다 μl의 전체 볼륨을하여 세포 농도를 곱한하면 전체 휴대폰 번호를 제공합니다. 이 프로토콜은 인간의 신경 줄기 / 전구체 세포 (hNSPCs)를 계산 설명뿐만 아니라, 많은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다.
Protocol
인간 신경 줄기 세포를 Passaging
참고 : 참조하십시오 Passaging 인간 신경 줄기 세포의 세포를 분리하고 resuspend하는 방법에 대한 기사. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
카운팅에 대한 세포 현탁액을 준비
- 0.4 % Trypan 블루 솔루션과 eppendorf 튜브에 세포 미디어 20 μl 장소 25 μl.
- 부드럽게 동질적인 중지를 만드는 미디어 알려진 볼륨에있는 세포가 들어있는 튜브를 감청하여 계산하는 세포를 Resuspend. eppendorf 튜브 이전 단계에서 세포로의 5 μl를 놓습니다. 이 단계는 10의 요인에 의해 세포 농도 dilutes.
- hemacytometer에 덮개 유리를 삽입하고, 세포 현탁액의 11-12 μl에 대한로드합니다.
Hemacytometer의 세포를 계산
- 위상 대조 현미경에 hemacytometer의 전체 격자를 관찰. 그리드 중 하나 사분면 (예 : 빨간색 하나)에 중점을두고 있습니다.
- 자신의 멤브레인 손상 및 Trypan 파란색 염료를 제외 수 없습니다 되었기 때문에 죽었거나 죽어가는 세포는 파란색으로 나타납니다. 가능한 세포는 파란색으로 표시되지 않습니다과 위상 대조에 빛나는 "헤일로"( "위상 밝은"됩니다)에 둘러싸여 것입니다.
- 한 사분면 (지역 1mm 2) 가능한 세포의 수를 계산합니다. 당신은 또한 세포의 총 숫자로 가능한 세포의 수를 나누어 세포 생존을 결정할 수 있습니다. 3-4 무작위 quadrants의 세포를 카운트하고 사분 당 세포의 평균 개수를 결정합니다. 사분면의 볼륨이 10 -4 ML 또는 0.1 μl 것으로 알려져 있기 때문에, 세포의 농도는 결정 수 있습니다
- 당신은 # 전지 / μl를 결정하기 위해 다음과 같은 바로 가기를 사용할 수 있습니다 :
튜브 # 튜브에 세포의 총 = # 전지 / μl X μl
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Discussion
이 프로토콜은 세포를 포함하는 실험의 다양한 세포 농도를 결정하기 위해 간단한 신속한 방법을 설명합니다. 3D에서 설명하는 바로 가기를 사용하여, 하나는 신속하고 정확하게 세포 농도와 주어진 볼륨에서 전체 휴대폰 번호를 확인할 수 있습니다.
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Acknowledgments
저자는 어린이의 병원, hNSPC 문화를 제공하는 오렌지 카운티 연구소 국립 인간 신경 줄기 세포 자원의 박사 필립 H. 슈워츠을 인정하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
