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Biology

人类神经干细胞计数

doi: 10.3791/262 Published: August 22, 2007

Summary

知识是需要许多组织培养操作活菌的确切人数。本协议描述了如何区分活细胞和死细胞和使用hemacytometer量化细胞。虽然它描述了人类神经干/前体细胞(hNSPCs)计数,它可用于其他类型的细胞。

Abstract

活细胞中的一个细胞悬液体积的确切数目的知识是必需的,如电镀细胞免疫细胞化学或细胞转染,许多日常的组织文化的操作。本协议描述了一个简单,快速的方法,区分活细胞和死细胞和量化的细胞浓度和细胞总数使用hemacytometer。这个过程首先需要分离从表面生长的细胞,他们在媒体resuspending。下一步,在台盼蓝(理想的浓度,将给予20-50%象限细胞)溶液稀释细胞,放在hemacytometer。最后,在随机选择的几个象限平均活菌计数,除以一个1 毫米 2象限(0.1μL),乘以稀释倍数的体积平均给每L.细胞的数量μL总体积乘以该细胞浓度,细胞总数。本协议描述了人类神经干/前体细胞(hNSPCs)计数,但也可以用于许多其他类型的细胞。

Protocol

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传代人类神经干细胞

:请参阅的传代人类神经干细胞 如何分离和悬浮细胞的文章http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263

准备用于计数细胞悬液

  1. 将25μL0.4%台盼蓝溶液和20μL细胞介质到Eppendorf管。
  2. 悬浮轻轻拍打管包含在媒体的已知体积的细胞创造一个同质的悬挂计数细胞。 5μL的细胞放入Eppendorf管中,从上一步。这一步稀释细胞浓度的10倍。
  3. hemacytometer放在玻璃盖,和负载约11-12μL的细胞悬液。

    262_Figure - 01

Hemacytometer细胞计数

  1. 相衬显微镜观察整个电网的hemacytometer。专注于网格的一个象限(如红色)。

    262_Figure - 02

  2. 死亡或濒临死亡的细胞会出现蓝色的,因为他们的膜已损坏且不能排除台盼蓝染色的。活菌不会出现蓝色将由相衬的“光环”(将“相亮”)所包围。
  3. 计数在一个象限(面积1平方毫米 )的活菌数。您也可以决定细胞活力,细胞总数除以活菌数。在3-4随机象限的细胞计数,并确定每个象限的细胞平均数量。由于象限的体积是已知的10 -4毫升或0.1μL,细胞的浓度可


    262_Figure - 03


  4. 您可以使用以下快捷方式来确定#细胞/μL:

    262_Figure - 04

    #管细胞总数=#细胞/μLXμL管

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Discussion

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本协议描述了一个简单和快速的方式,各种涉及细胞的实验,以确定细胞浓度。使用在3D中描述的快捷方式,可以快速,准确地判断细胞浓度和细胞总数在给定的体积。

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Acknowledgments

作者要感谢在儿童医院,奥兰治县提供hNSPC文化研究所的菲利普H ·施瓦茨博士国家人类神经干细胞资源。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Phase Contrast Hemacytometer Tool Hausser Scientific 02-671-54 Distributed by Fisher under the indicated catalog #
Trypan Blue Stain 0.4% Reagent GIBCO, by Life Technologies 15250-061 Distributed by Invitrogen under the indicated catalog #

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References

  1. Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
  2. Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
  3. Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
人类神经干细胞计数
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Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).More

Marchenko, S., Flanagan, L. Counting Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e262, doi:10.3791/262 (2007).

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