Summary
Conoscenza del numero esatto di cellule vitali è necessaria per manipolazioni molte colture di tessuti. Questo protocollo descrive come distinguere tra cellule vive e morte e quantificare le cellule utilizzando un emocitometro. Anche se descrive il conteggio umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), può essere utilizzato per altri tipi di cellule.
Abstract
Conoscenza del numero esatto di cellule vitali in un dato volume di una sospensione cellulare è richiesto per molte manipolazioni di routine di coltura, come le cellule placcatura per immunocitochimica o per transfezione delle cellule. Questo protocollo descrive un metodo semplice e veloce per la differenziazione tra cellule vive e morte e quantificare la concentrazione delle cellule e il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro. Questa procedura richiede in primo distacco delle cellule da una superficie di crescita e risospendere in media. Successivamente, le cellule sono diluiti in una soluzione di Blu tripano (idealmente ad una concentrazione che darà 20-50 cellule per quadrante) e collocato nella emocitometro. Infine, la media dei conteggi di cellule vitali in diversi quadranti selezionati in modo casuale, dividendo la media per il volume di un 1 mm 2 quadranti (0,1 mL) e moltiplicando per il fattore di diluizione fornisce il numero di cellule per l. Moltiplicando questa concentrazione di cellule per il volume totale in microlitri dà il numero totale delle cellule. Questo protocollo descrive il conteggio umano neurali staminali / precursori delle cellule (hNSPCs), ma può anche essere usato per molti altri tipi di cellule.
Protocol
Passaging cellule staminali neuronali
Nota: Si prega di fare riferimento al Passaging Cellule staminali neurali umane articolo su come staccare e risospendere le cellule. http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
Preparazione della sospensione cellulare di conteggio
- Mettere 25 ml di soluzione 0,4% Tricloroetano e 20 l di media cellule in una provetta Eppendorf.
- Risospendere le cellule da contare picchiettando delicatamente la provetta contenente le cellule in un volume noto di media per creare una sospensione omogenea. Mettere 5 ml di cellule nel tubo eppendorf dal passaggio precedente. Questo passo diluisce la concentrazione cellulare di un fattore 10.
- Posizionare il vetro di copertura sul emocitometro e caricare circa 11-12 ml di sospensione cellulare.
Conteggio delle cellule nel emocitometro
- Osservare l'intera griglia dei emocitometro in un microscopio a contrasto di fase. Focus su un quadrante della griglia (come quello in rosso).
- Le cellule morte o morenti apparirà azzurro perché la loro membrana è stato danneggiato e non sono in grado di escludere il colorante Blu tripano. Cellule vitali non appare blu e sarà circondato da un "alone" di luce in contrasto di fase (sarà "fase luminosa").
- Contare il numero di cellule vitali in un quadrante (area 1 mm 2). È inoltre possibile determinare la vitalità cellulare dividendo il numero di cellule vitali per il numero totale delle cellule. Contare le celle in 3-4 quadranti casuale e determinare il numero medio di cellule per ogni quadrante. Poiché il volume di un quadrante è noto per essere da 10 ml -4 o 0,1 microlitri, la concentrazione di cellule può essere determinata
- È possibile utilizzare il collegamento seguente per determinare il # cellule / ml:
# Totale di cellule in provetta le cellule = # / X microlitri microlitri in tubo
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Discussion
Questo protocollo descrive un modo semplice e rapido per determinare la concentrazione cellulare per una serie di esperimenti che coinvolgono le cellule. Usando la scorciatoia descritti in 3d, si può rapidamente e con precisione determinare la concentrazione cellulare ed il numero totale di cellule in un dato volume.
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Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Philip H. Schwartz del National Human Resource neurale delle cellule staminali presso l'Ospedale dei Bambini s, Orange County Istituto di Ricerca per la fornitura di culture hNSPC.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
