Summary
Canlı hücreler tam sayısının Bilgi, birçok doku kültürü manipülasyonlar için gereklidir. Bu protokol, canlı ve ölü hücreleri arasındaki ayrım ve hemasitometre kullanarak hücrelerin miktarını nasıl açıklamaktadır. Insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) sayma açıklar olsa da, diğer hücre türleri için kullanılabilir.
Abstract
Immünsitokimya veya hücre transfections için kaplama hücreleri gibi birçok rutin doku kültürü manipülasyonlar, bir hücre süspansiyonu belirli bir hacmi canlı hücreler tam sayısının Bilgi için gereklidir. Bu protokol, canlı ve ölü hücreleri arasındaki farklılıklarda ve hücre konsantrasyonu ve toplam hücre sayısı hemasitometre kullanarak miktarının belirlenmesi için basit ve hızlı bir yöntem açıklanır. Bu prosedür, öncelikle bir büyüme yüzey hücreleri ayırma ve medya onları resuspending gerektirir. Sonra, hücrelerin Tripan mavi (ideal kadran başına 20-50 hücre verecek bir konsantrasyon) bir çözüm seyreltilmiş ve hemasitometre yerleştirilir. Son olarak, biri 1 mm 2 kadranda (0,1 ul) ve seyreltme faktörü ile çarpılarak hacmi ortalama bölme, rastgele seçilen birkaç kadran ortalama canlı hücrelerin sayılarını l. ortalama hücre sayısını verir Ul toplam hacmi bu hücre konsantrasyonu Çarpma toplam hücre sayısını verir. Bu protokol, insan sinir kök / prekürsör hücrelerinin (hNSPCs) sayma açıklar, aynı zamanda birçok diğer hücre türleri için kullanılabilir.
Protocol
İnsan Nöral Kök Hücreler Pasajlanması
Not: Lütfen bakınız Pasajlanması İnsan Nöral Kök Hücreler , hücreleri ayırmak ve tekrar süspansiyon nasıl makale . http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
Sayma Hücre Süspansiyon hazırlanması
- Yeri 25% 0.4 Tripan Blue çözüm ve Eppendorf tüp içine hücre medya 20 ul ul.
- Medya bilinen bir hacmi hücreleri içeren homojen bir süspansiyon oluşturmak için tüp hafifçe dokunarak sayılmak üzere hücreleri tekrar Hücre 5 ul Eppendorf tüp önceki adımda içine yerleştirin. Bu adım, 10 kat hücre konsantrasyonu sulandırır.
- Hemasitometre cam kapak yerleştirin ve yaklaşık 11-12 ul hücre süspansiyonu yüklemek.
Hemasitometre hücreler Sayma
- Bir faz kontrast mikroskopta hemasitometre tüm ızgara dikkat edin. Izgara bir kadranda (örneğin kırmızı biri olarak) odaklanın.
- Ölü veya ölmekte olan hücrelerin membran hasar ve Tripan mavi boya dışlamak mümkün değildir çünkü mavi görünecektir. Canlı hücreler mavi görünmez ve faz kontrast ışık "halo" ("faz-parlak" olacaktır) ile çevrili olacak.
- Canlı hücrelerinin sayısını bir çeyrek (alan 1 mm 2). Ayrıca, hücrelerin toplam sayısına göre canlı hücreler sayısına bölünmesiyle hücre canlılığı belirleyebilirsiniz. 3-4 rastgele kadran hücre sayımı ve kadran başına bir hücre ortalama sayısını belirlemek. Bir kadran hacmi 10 -4 ml veya 0.1 ul olduğu bilinen bu yana, hücre konsantrasyonu tespit edilebilir
- # Hücre / ml belirlemek için aşağıdaki kısayolu kullanabilirsiniz:
# Tüp tüp hücreleri Toplam = # hücre / ml X ul
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, çeşitli hücreleri içeren deneyler bir hücre konsantrasyonu belirlemek için basit ve hızlı bir şekilde açıklamaktadır. 3d açıklanan kısayolu kullanarak, hızlı ve doğru bir hücre konsantrasyonu ve belirli bir hacmi toplam hücre sayısı belirleyebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar, Çocuk Hastanesi, Orange County hNSPC kültürleri Araştırma Enstitüsü Ulusal İnsan Nöral Kök Hücre Kaynak Dr. Philip H. Schwartz kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR. Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008).
- Caprette, D. avidR. Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).
