Summary
우리는 전체 마운트 immunohistochemistry를 소개하고 레이저 마우스 배아 사지 피부에 복잡한 혈관 네트워크 형성을 분석하는 데 여러 상표와 공촛점 현미경을 검사합니다.
Abstract
이미지에 대한 전체 마운트 immunohistochemical 분석은 전체 vasculature는 morphogenesis을 분기의 세포 메커니즘을 이해하는 데 필수적입니다. 우리는 기존의 원시 모세관 신경 얼기가 계층 브랜츠드 혈관 네트워크에 개편되는 혈관 개발을 연구하기 위해 사지 피부 vasculature 모델을 개발했습니다. 여러 개의 라벨과 함께 전체 - 마운트 공촛점 현미경 특정 형광 마커를 사용하여 내피 세포, pericytes 및 평활근 세포를 포함하여 그대로 혈관뿐만 아니라 자신의 세포 구성 요소의 강력한 이미징을 허용합니다. 유전자 연구와 함께 사지 피부 vasculature 모델의 발전은 혈관 개발 및 patterning의 분자 메커니즘을 이해하고 개선합니다. 사지 피부 vasculature 모델은 말초 신경이 동맥의 차별과 patterning을위한 공간 템플릿을 제공하는 방법을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 동영상이 문서에서는 우리가 혈관 개발의 과정에 따라 수 있습니다 vascularized 배아 기관에 대한 적용 혈관 특정 항체 및 형광 항체 보조와 완전한 혈관을 얼룩이 간단하고 강력한 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
1. 수집 마우스 배아 림브 스킨 (E13.5 ~ E17.5)
- 안락사는 승인 절차에 의해 암컷을 연결. 우리의 승인된 동물 프로토콜에 따르면, 여자는 CO 2 노출에 의해 euthanized하고 다음 경추 전위에 의해 안심하시기 바랍니다. 의 흡수 종이 타월에 동물을 배치하고 스퀴즈 병에서 70% EtOH / H 2 O에서 철저하게 그것을 만끽해보세요.
- 자궁은 그대로 해부하다 피로를 씻어 차가운 행크스 '밸런스드 소금 솔루션 (HBSS)이있는 100 X 15mm 페트리 접시에 놓으십시오.
- 배아를 분리하고 해부하다. 배아에서 매우 얇은 양막을 제거합니다.
- 각각의 배아는 genotyped해야하는 경우 (옵션) 35 X 10mm 페트리 접시에서 단일 배아를 해부하다. 해부 꼬리는 genotyping의 0.2 ML PCR 튜브로 전송됩니다.
- 배아의 앞발로를 차단하고 전송 인산 버퍼 살린 (PBS)에 얼음처럼 차가운 신선한 4 % Paraformaldehyde (PFA) 2 ML을 포함한 24 잘 접시에 고리 집게로 앞발.
- 4 ° C 하룻밤에 Nutator 믹서에 부드러운 믹싱으로 앞발을 고정.
- 다음날, PFA를 제거하고 실온에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합과 PBS 2 ML 5 분 세 번 씻으십시오.
- 100 % 메탄올 (MeOH)에 앞발을 전송하고 -20 ° C의 효소 냉동고 (임계 온도 제어와 자동 서리를 없애다 기능없이 냉동실)에 그들을 저장할 수 있습니다. 차 항체는 100 % MeOH 치료 후 표 1에 나열된 작업.
- 고급 핀셋을 사용하여 forelimb에서 출발 피부 껍질. 림브 피부, 탈수, 갈기갈기 쉽게 분리해야합니다. 우선 직면 복부 측면 (손바닥 쪽)와 다리를 놓으십시오. 동영상과 같이 다음 고급 핀셋을 사용하여 피부를 잘라. 다음 손상없이 부드럽게 피부를 벗겨내는, 전체를 사지 주변 해부하다.
2. 림브 스킨 전체 - 마운트 Immunohistochemical 스테 이닝
- MeOH / PBT (PBS + 0.2 % 트리톤 X - 100) (75 %, 50 %, 25 %) 5 분 각각의 등급 시리즈를 통해 잠복기에 의해 5ml 폴리 프로필렌 왕복 아래 튜브의 사지 스킨을 Rehydrate. 솔루션을 교환하면 사지 스킨 손상을 방지하기 위해주의를 기울여야합니다.
- 상온에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합과 PBT에서 5 분 두 번 씻으십시오.
- Nutator 믹서에서 부드러운 혼합 2 시간 동안 당나귀 차 항체에 대한 10 %의 염소 차 항체에 대한 혈청 / PBS 0.2 % TX100 차단 버퍼 염소 또는 10% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100 차단 버퍼에서 하나와 사지 스킨 블럭 상온.
- 차단 버퍼의 기본 항체의 800μl (테이블에 나열된 적절한 희석) (와 2ml - microcentrifuge 관에 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 플레이스 중 10 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 10% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100). 4 ° C 하룻밤에 Nutator 믹서에 부드러운 믹싱으로 사지 스킨을 품어. 종 (예를 들어, 쥐의 단클론 항체 polyclonal 항체 + 토끼)에서 파생된 여러 기본 항체를 동시에 사용할 수 있습니다.
- 다음날, 세척 버퍼의 4ml (중 2 %의 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 2 왕복 하단 튜브 5ml 폴리 프로필렌으로 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 장소 % 동키 혈청 / PBS 0.2 % TX100).
- 부드러운 실온에서 Nutator 믹서에서 혼합과 함께 15 분 다섯 번 씻으십시오.
- 차단 버퍼 이차 항체의 800μl (중 10 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100하거나 10% 돈키 혈청 /를 함께 2ml - microcentrifuge 관에 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 플레이스 PBS 0.2 % TX100). 일반적으로 우리는 잭슨 ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 dilutions) 또는 Invitrogen (알렉사 플루어 488, 알렉사 플루어 568, 알렉사 플루어 633, 1:250 희석)에서 보조 항체를 사용합니다. 보조 항체의 집계 입자를 제거하는 0.22μm PVDF 막 주사기 필터를 사용하여 보조 항체 솔루션을 필터링합니다. 상온에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합 1 시간 동안 어둠이나 알루미늄 호일로 싼에서 사지 스킨을 품어. 종에서 파생된 다른 형광 복합 이차 항체를 동시에 사용할 수 있습니다.
- 세척 버퍼의 4ml (2 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % 중 TX100 또는 2% 돈키 혈청 / PBS로 5ml 폴리 프로필렌 왕복 하단 튜브에 고리 집게로 35 X 10mm 페트리 접시와 전송에 사지 스킨을 플레이스 0.2 % TX100). 어둠이나 부드러운 실온에서 Nutator 믹서에서 혼합과 알루미늄 호일로 싸서 15 분 다섯 번 씻으십시오.
- (핵에 대한 counterstaining에 대한 옵션)는 세척 버퍼의 4ml (중 2 %의 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 2% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100)에 - PRO - 3 (Invitrogen T3605과 함께 사지 스킨을 품어 , 어둠 또는 객실 temperatu에서 Nutator 믹서에서 부드러운 혼합 10 분 알루미늄 호일로 싼에서 1:3000 희석)다시. 그런 다음에 부드러운 혼합과 알루미늄 호일로 어둡거나 포장의 세척 버퍼의 4ml (2 % 염소 혈청 / PBS 0.2 % TX100 또는 2% 돈키 혈청 / PBS 0.2 % TX100을)를 5 분 세 번 씻어 상온에서 Nutator 믹서. 핵에 대한 강력하고 구체적인 얼룩이 특정 방출 (HeNe 633 나노미터 여기)에서하려면 - PRO - 3에 대한 관찰됩니다.
3. 슬라이드에 림브 스킨 장착
- 35 X 10mm 페트리 접시에 사지 스킨을 놓습니다. 표백 광범위한 사진을 피하기 위해 낮은 조명과 stereomicroscope 이하 벌금 핀셋을 사용하여 스킨의 내부 계층에서 먼지, 크리스탈, 섬유를 제거합니다.
- 고리 집게에 의해 접착제 현미경 슬라이드 사지 스킨을 전송합니다. 슬라이드 (coverslip으로 IE)에서 위쪽으로 누워 내부 레이어로 피부를 놓습니다. 신중하게 잘 핀셋을 사용하여 스킨을 평평하게하고 Kimwipe하여 버퍼를 세척 - 이월 제거하십시오.
- 기포없이 안티 - 페이드 장착 매체 마운트합니다. 우리는 25 "x25"coverslip을 사용합니다. 어둠의 평평한 표면에 치료 (예 : 샘플보기 전에 실온에서 어둠 속에서 야간 배치 골드 시약을 연장 사용하여 마운트). 장기 저장을 위해, 4 슬라이드에 coverslip하고 저장을 날인 ° C.
4. 공촛점 현미경
- fluorophores에 적합한 레이저를 설정합니다. 우리는 아르곤 488nm (알렉사 플루어 488와 GFP)을, DPSS 561nm (알렉사 플루어 568와 Cy3) 및 HeNe 633nm (알렉사 플루어 633, Cy5 및 - PRO - 3)을 포함하여 세 레이저 소스 Leica TCS SP5 공촛점 현미경을 사용하여 .
- 더블 또는 트리플 묻은 샘플의 모든 염료가 동시에 흥분됩니다되는 누화를 방지하거나 줄이기 위해 순차적 스캔 도구를 사용하십시오. 순차 스캔 모드에서는, 이미지가 순차적으로 기록됩니다.
- 여기에 대한 형광 염료와 레이저에 대한 더 일반적인 정보는 힙스 (2004)에 의해 "생물학에 대한 공촛점 현미경"의 설립 수 있습니다
5. 대표 결과
팬 - 내피 세포 마커에 항체와 E15.5에서 마우스 forelimb의 피부에 전체 마운트 트리플 라벨 공촛점 immnofluorescence 현미경 PECAM - 1 (그림 1A - C, D 블루), neurofilament 마커 2H3 (그림 1A 녹색), 그리고 평활근 세포 마커 αSMA (그림 1A, B 적색)는 사지 피부에 2H3 + 주변 신경에 부합 αSMA + 동맥의 특성 분기 패턴을 공개했다. 분기 혈관뿐만 아니라,이 사지 피부 vasculature 모델은 림프 내피 세포 마커 LYVE - 1 (그림 1D, E 적색)와 Neuropilin2 (NRP2) (그림 1D, F 녹색으로 항체를 사용하여 분기 림프 혈관의 patterning을 연구하는 데 사용됩니다 ).
그림 1. (AC) 동맥은 태아의 사지 피부에 말초 신경로 맞춥니다. 팬 - 내피 세포 마커 PECAM - 1 (AC, 파랑), neurofilament 마커 2H3 (A, 녹색), 그리고 평활근 세포 마커 αSMA (A와 B, 빨간색으로 항체와 함께 전체 마운트 트리플 라벨 공촛점 immnofluorescence 현미경 )이 표시됩니다. E15.5, 2H3 +에서 말초 신경 (오픈 화살표) αSMA에 의해 덮여 동맥 (화살촉) + 평활근 세포와 연결합니다. 배아 사지 피부에 (DF) 림프 vasculature. 팬 - 내피 세포 마커에 항체 PECAM - 1 (D, 파랑), 림프 내피 세포 마커 LYVE - 1 (D와 E, 빨간색)와 Neuropilin2 (NRP2) (D와 F, 녹색과 함께 트리플 라벨 공촛점 immnofluorescence 현미경 )이 표시됩니다. LYVE - 1도 macrophages (오픈 화살촉)의 하위 집합에 의해 표현된다 반면에 림프 혈관은 LYVE - 1 NRP2 모두에 의해 시각입니다. 스케일 바 : 100μm.
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Discussion
그것이 충분한 산소와 장기에 영양분을 공급하기 때문에 혈관 시스템은 embryogenesis 동안뿐만 아니라 성인의 장기 유지 보수 및 생식 기능에 대한 장기 개발을 위해 매우 중요합니다. 적절한 혈관 네트워크는 기존의 모세관이 높은 분기와 계층 구조를 개편하고있는 angiogenesis에 의해 복잡하고 여러 단계의 프로세스를 잘 설정됩니다. 다수의 작품이 분자의 다양한 이러한 과정에 관여하는 것으로 나타났습되어 있지만, 그것은 장기 또는 구성 요소가 혈관 분기의 내피 분화 및 patterning을 포함한 혈관 개발의 stepwise 과정을 촉진하는 신호를 제공하는 방법을 명확되지 않았습니다. 이 질문을 해결하기 위해, 우리는 혈관 개발의 과정에 따라 수 있습니다 적절한 vascularized 기관이 필요합니다. 이득의 기능과 손실의 기능을 유전자 조작과 사지 피부 vasculature 모델은 혈관 개발의 고해상도 분석이 가능합니다.
우리는 여기서 배아 마우스 앞발의 해부 전체 장착 immunohistochemical 얼룩과 정기적으로 사지 피부 angiogenesis와 lymphangiogenesis을 분석하기 위해 실험실에서 사용되는 공촛점 현미경을 포함한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 초기뿐만 아니라 늦은 배아 사지 피부가 쉽게 공촛점 현미경으로 몇 군데 있습니다에 대한 재현성 결과와 그대로 vasculature을 제공합니다. 그것은 또한 성인 귀에 피부 vasculature (YM 및 K. 퍼킨스되지 않은)에 적용됩니다. 을 추가하지만, 찬란 표시 혈관과 zebrafish 같은 다른 동물 모델은 높은 해상도로 생체내에서 vasculature의 시간 경과 이미징에 유용, 혈관의 성장과 리모델링의 역학의 이미징을 탐험해보세요.
혈관 표시하여 여러 라벨과 함께 전체 - 마운트 공촛점 현미경 이미지 혈액과 림프 내피 세포 우리를 허용하고 스킨에있는 평활근 세포와 pericytes 포함한 이웃. 혈관 마커 항체 (표 2)뿐만 아니라, 여러분의 흥미 내생 유전자의 표현 패턴을 요점을 되풀이하다 리포터 유전자 제품 (β - galactosidase, β - 여자와 녹색 형광 단백질, GFP, 표 2)에 대한 항체를 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 ephrinB2 또는 EphB4의 histochemical 표시기를 제공 ephrinB2 (왕 외., 1998) 또는 EphB4 로커스 (Gerety 외., 1999), 타겟으로 lacZ 기자를 들고 배아에서 forelimb 피부를 사용합니다. EphrinB2, transmembrane의 리간드는 그 수용체 반면 동맥 아니지만 정맥에 의해 표현, 티로신 키나제 EphB4은 우선적으로 정맥 (왕 외., 1998)에 의해 표시됩니다. E15.5 ephrinB2 lacZ / + 또는 EphB4 lacZ / + heterozygous 배아의 forelimb 스킨에서 전체 마운트 immunohistochemical 분석은 말초 감각 신경이 동맥 혈관과 우선적으로 관련된 것으로 나타났습니다 (Mukouyama 외. 2002). 이 생쥐는 잭슨 연구소 (주식 # 006039, Ephb4 tm1And / J : 재고 없음 # 006044 Efnb2 tm1And / J)에서 사용할 수 있습니다.
이러한 혈관 시스템의 서로 다른 단계의 연구는 혈관 분기, 동맥 / 정맥 차별화, 림프 혈관 개발 및 개발 사지 피부의 평활근 / pericyte 범위를 포함한 angiogenesis의 세포 역학을 보여줍니다. E13.5으로, 원시 모세관 신경 얼기는 사지 피부에 설립했지만, 감각 신경 및 혈관 사이에는 연관이 관찰되지 않았습니다. E14.5으로 혈관 개조가 발생하고 동맥 내피 세포의 마커를 표현하고 αSMA + 평활근 세포 (Mukouyama 외. 2002)가 리모델링 브랜츠드 혈관과 관련된 신경. 유전자 연구는 말초 감각 신경이 혈관 분기 패턴과 동맥 차별화 결정에 대한 템플릿 (Mukouyama 외 있습니다. 2002 년)를 제공하는 것이 좋습니다. 신경 Vegf - A 조건 돌연변이의 분석 신경 파생 VEGF가 - A는 사지 피부 vasculature의 동맥 차별 화를위한 필요하다는 것을 밝혀 (Mukouyama 외. 2005). 우리의 결과는 또한 신경 Vegf - A 조건 돌연변이 추가 angiogenic 요인 (들)의 참여를 나타내는 신경 선박 정렬 적은 손상을 전시 것으로 나타났다. 이것은 사지 피부 vasculature 모델 우리가 혈관의 동맥 분기 차별과 patterning을 제어 서로 다른 메커니즘을 연구 허용 제안합니다. 또한, 어떤 분기 정맥과 림프 혈관의 정맥 차별과 patterning을 제어하는 것은 아직 답변으로 남아 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 마우스 사육 및 관리와 지원 및 실험실 관리 K. 길 주셔서 감사합니다. 또한 기술적인 도움을 무코 야마 연구실 회원에게 감사드립니다. 자금은 보건 Naitonal 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 제공되었다.
Materials
Antibodies Pan-endothelial cell marker
Arterial endothelial cell marker
Venous endothelial cell marker
Lymphatic endothelial cell marker
Smooth muscle cell/pericyte marker
Antibodies forGFP reporter
Antibodies for LacZ reporter
Antibodies for peripheral axon
Antibodies for migrating Schwann cells
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. |
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References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
