Whole-Mont analyse immunohistochimique à la vascularisation cutanée Limb embryonnaires: un modèle pour l'étude vasculaire morphogenèse de branchement de l'embryon

Summary

Nous introduisons une immunohistochimie toute monture et laser microscopie confocale à balayage avec un étiquetage multiple pour analyser la formation de complexes réseau vasculaire dans la peau de souris membres de l'embryon.

Abstract

Whole-Mont analyse immunohistochimique pour l'imagerie du système vasculaire entier est essentielle pour la compréhension des mécanismes cellulaires de ramification morphogenèse. Nous avons développé le modèle de la vascularisation des membres de peau pour étudier le développement vasculaire dans lequel un pré-existante primitive plexus capillaire est réorganisée dans un réseau hiérarchiquement ramifiée vasculaire. Whole-Mont microscopie confocale avec étiquetage multiple permet pour l'imagerie des vaisseaux sanguins robustes intactes ainsi que leurs composants cellulaires dont les cellules endothéliales, péricytes et cellules musculaires lisses, en utilisant des marqueurs fluorescents spécifiques. Les progrès dans ce modèle la vascularisation des membres peau avec des études génétiques ont permis d'améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires du développement vasculaire et les motifs. Le modèle vascularisation des membres peau a été utilisée pour étudier comment les nerfs périphériques fournissent un modèle spatial pour la différenciation et la structuration des artères. Cet article décrit un protocole vidéo simple et robuste pour colorer les vaisseaux sanguins intacts avec des anticorps spécifiques et vasculaires anticorps secondaires fluorescents, qui est applicable pour les organes embryonnaires vascularisées où nous sommes en mesure de suivre le processus du développement vasculaire.

Protocol

1. Collecte peau Limb embryonnaires de souris (E13.5 E17.5 ~)

1. Euthanasier branchée femelles par une procédure approuvée. Selon notre protocole animales approuvées, les femelles sont euthanasiés par le CO ₂ d'exposition et ensuite assurée par dislocation cervicale. Lay l'animal sur son papier absorbant et les tremper complètement dans 70% EtOH / H ₂ O à partir d'un flacon souple.
2. Disséquer l'utérus intact et le placer dans un plat de 100 x 15 mm de Petri contenant une solution glacée Hanks Balanced Salt (HBSS) pour laver le sang.
3. Séparée et disséquer l'embryon. Retirez l'amnios très mince de l'embryon.
4. (Option) Disséquer un seul embryon dans un plat de 35 x 10 mm de Petri, si chaque embryon doit être génotypés. La queue est disséqué transféré dans un tube de 0,2 ml par PCR pour le génotypage.
5. Coupez les pattes avant de l'embryon et le transfert des membres antérieurs par une pince à anneau en 24 plaques à puits contenant 2 ml de glace froide paraformaldéhyde à 4% frais (PFA) dans un tampon phosphate salin (PBS).
6. Fixer les pattes avant avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à 4 ° C pendant la nuit.
7. Le lendemain, retirer la PFA et laver trois fois pendant 5 min dans 2 ml de PBS avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à température ambiante.
8. Transférer les pattes avant dans le méthanol à 100% (MeOH) et les stocker à -20 ° C l'enzyme congélateur (le congélateur avec contrôle de température critique et sans fonction de dégivrage automatique). Les anticorps primaires énumérées dans le tableau 1 du travail après le traitement MeOH 100%.
9. Peler la peau hors de la patte avant en utilisant une pince à épiler fine. La peau du membre, quand déshydraté, devrait se séparent facilement de la branche. Placez d'abord le membre avec la face ventrale (côté paume) vers le haut. Ensuite, en utilisant une pince à épiler fine, couper la peau comme le montre la vidéo. Suivant disséquer autour du membre entier, desquamation de la peau en douceur hors sans aucun dommage.

2. Whole-Mont coloration immunohistochimique de Skins Limb

1. Réhydrater les peaux jambe en polypropylène à fond rond tube de 5ml en incubant à travers la série graduée de MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) pendant 5 min chacune. Notez que l'échange de solutions doit être prudent pour éviter d'endommager les peaux membre.
2. Laver deux fois pendant 5 min dans PBT avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à température ambiante.
3. Bloquer les peaux de chèvre soit membre avec 10% de sérum / PBS 0,2% TX100 tampon de blocage des anticorps secondaire de chèvre ou de 10% de sérum d'âne / PBS 0,2% TX100 tampon de blocage pour les anticorps secondaires âne pendant 2 heures en mélangeant doucement sur la table de mixage au Nutator la température ambiante.
4. Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri et le transfert par une pince à anneau dans 2ml-microcentrifugeuse tube avec 800μl d'anticorps primaire (dilution appropriée comme indiqué dans les tableaux) dans le tampon de blocage (soit 10% de sérum de chèvre / PBS 0,2 TX100% ou 10% de sérum d'âne / PBS 0,2% TX100). Incuber les peaux membre avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à 4 ° C pendant la nuit. Notez que plusieurs anticorps primaires provenant d'espèces différentes (par exemple, anticorps monoclonal de rat + anticorps polyclonal de lapin) peuvent être utilisés simultanément.
5. Le lendemain, place les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm et le transfert de Petri par une pince à anneau en polypropylène de 5 ml à fond rond tube avec 4 ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2 TX100 % âne sérum / PBS 0,2% TX100).
6. Lavez cinq fois pendant 15 min en mélangeant doucement sur la table de mixage Nutator à température ambiante.
7. Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri et le transfert par une pince à anneau dans 2ml-microcentrifugeuse tube avec 800μl d'anticorps secondaire dans le tampon de blocage (soit 10% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 10% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100). Typiquement, nous utilisons des anticorps secondaires de Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 dilutions) ou Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 dilution). Filtrer la solution d'anticorps secondaire en utilisant les filtres 0.22μm PVDF seringue membrane pour éliminer les particules agrégées de l'anticorps secondaire. Incuber les peaux des membres dans l'obscurité ou enveloppés de papier d'aluminium pendant 1 heure avec mélange en douceur sur la table de mixage Nutator à température ambiante. Notez que différents anticorps secondaires conjugués fluorescents provenant d'espèces différentes peuvent être utilisées simultanément.
8. Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri et le transfert par une pince à anneau en polypropylène à fond rond tube de 5ml avec 4ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100). Lavez cinq fois pendant 15 min dans le noir ou enveloppés de papier d'aluminium en mélangeant doucement sur la table de mixage Nutator à température ambiante.
9. (Option pour une contre-coloration contre le noyau) Incuber les peaux membre avec 4ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100) avec A-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 dilution) dans le noir ou enveloppés de papier d'aluminium pendant 10 min en mélangeant doucement sur la table de mixage à la salle Nutator temre. Ensuite, laver trois fois pendant 5 min avec 4ml de tampon de lavage (soit 2% de sérum de chèvre / PBS 0,2% ou 2% TX100 âne sérum / PBS 0,2% TX100) dans l'obscurité ou enveloppés par des feuilles d'aluminium en mélangeant doucement sur le le mélangeur Nutator à température ambiante. Notez que la coloration forte et spécifique pour les noyaux est observé pour TO-PRO-3 dans une émission spécifique (excitation HeNe nm 633).

3. Montage du Skins Limb à la diapositive

1. Placez les peaux des membres sur un plat de 35 x 10 mm de Pétri. Retirez les poussières, cristaux, fibres de la couche interne de la peau en utilisant une pince à épiler amende en vertu du stéréomicroscope avec éclairage basse pour éviter la photo blanchissement.
2. Transférer les peaux branche à lame de microscope par un adhésif pinces. Placez les peaux avec la couche interne couché à la hausse sur la diapositive (c'est à dire vers la lamelle). Aplatir les peaux attentivement l'aide de pinces fines et retirer le report du tampon de lavage par Kimwipe.
3. Monter dans les médias anti-fade montage sans bulles d'air. Nous utilisons 25 "x25" lamelle. Cure sur une surface plane dans l'obscurité (par exemple, les échantillons montés à l'aide de réactifs Prolongez l'or sont placés la nuit dans l'obscurité à température ambiante avant de visualisation). Pour stockage à long terme, sceller la lamelle sur la lame et stocker à 4 ° C.

4. Microscopie confocale

1. Mettre en place des lasers appropriés pour les fluorophores. Nous utilisons Leica TCS SP5 microscope confocal avec trois sources laser Argon dont 488nm (pour Alexa Fluor 488 et GFP), DPSS 561nm (pour Alexa Fluor 568 et Cy3) et HeNe 633nm (pour Alexa Fluor 633, Cy5 et A-Pro-3) .
2. Utilisez l'outil de scan séquentiel pour éviter ou réduire la diaphonie dans lequel tous les colorants dans les échantillons de double ou triple-tachés seront excités au même moment. Dans le mode de scan séquentiel, les images seront enregistrées dans un ordre séquentiel.
3. Des informations plus générales sur les colorants fluorescents et des lasers pour l'excitation peut être créée en «microscopie confocale pour les biologistes» par Hibbs (2004)

5. Les résultats représentatifs

Whole montage de microscopie confocale triple label immnofluorescence chez la souris forelimb peau à E15.5 avec des anticorps pour le marqueur de cellules endothéliales pan-PECAM-1 (figure 1A-C, D bleu), le marqueur de neurofilaments 2H3 (figure 1A vert), et le bon marqueur de cellules musculaires αSMA (figure 1A, B rouge) a révélé un aspect caractéristique de branchement des artères ⁺ αSMA, aligné avec 2H3 ⁺ nerfs périphériques dans la peau des membres. En plus de ramifications des vaisseaux sanguins, ce modèle vascularisation des membres peau est utilisée pour étudier la structuration des vaisseaux lymphatiques de branchement en utilisant des anticorps dirigés contre le marqueur de cellules endothéliales lymphatiques LYVE-1 (figure 1D, E rouge) et Neuropilin2 (NRP2) (figure 1D, F verte ).

Figure 1. (Ca) Artères aligner avec les nerfs périphériques dans la peau membres de l'embryon. Whole montage triple label microscopie confocale immnofluorescence avec des anticorps pour le marqueur de cellules endothéliales pan-PECAM-1 (AC, bleu), le marqueur de neurofilaments 2H3 (A, vert), et la douceur des cellules musculaires marqueurs αSMA (A et B, rouge ) est montré. À E15.5, 2H3 ⁺ nerfs périphériques (flèches ouvertes) associer à des artères (flèches) qui sont couverts par αSMA ⁺ cellules musculaires lisses. Vascularisation lymphatique (DF) dans la peau membres de l'embryon. Triple-label microscopie confocale immnofluorescence avec des anticorps pour le marqueur de cellules endothéliales pan-PECAM-1 (D, bleu), le marqueur de cellules endothéliales lymphatiques LYVE-1 (D et E, rouge) et Neuropilin2 (NRP2) (D et F, vert ) est montré. Les vaisseaux lymphatiques sont visualisés par les deux LYVE-1 et NRP2, alors LYVE-1 est également exprimée par un sous-ensemble des macrophages (flèches ouvertes). Barre d'échelle: 100 microns.

Discussion

Le système vasculaire est crucial pour le développement des organes pendant l'embryogenèse ainsi que pour l'entretien des organes et des fonctions de reproduction chez les adultes, car il fournit suffisamment d'oxygène et de nutriments aux organes. Une bonne réseau vasculaire est bien établie avec des processus complexes et multi-étapes par l'angiogenèse dans lequel pré-existante du réseau capillaire est réorganisée avec des structures très ramifiées et hiérarchique. Bien que de nombreux travaux ont démontré que une variété de molécules est impliquée dans ces processus, il n'a pas été clairement comment les organes ou de leurs composants fournissent les signaux de promouvoir le processus par étapes du développement vasculaire endothéliale et notamment la différenciation des motifs vasculaires branchement. Pour répondre à cette question, appropriée organes vascularisés, où nous sommes en mesure de suivre le processus du développement vasculaire sont nécessaires. Le modèle vascularisation des membres de peau avec un gain de fonction et la perte de fonction de manipulations génétiques à haute résolution permet l'analyse du développement vasculaire.

Nous décrivons ici un protocole détaillé incluant la dissection des membres antérieurs embryonnaires de souris, l'ensemble de montage coloration immunohistochimique et la microscopie confocale qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour analyser l'angiogenèse et la lymphangiogenèse la peau des membres. Le protocole fournit des résultats reproductibles et de la vascularisation intacte pour le début ainsi que la fin de la peau membres de l'embryon est facilement imagée par microscopie confocale. Elle est également applicable pour les adultes l'oreille peau vasculaire (YM et K. Perkins, inédit). Pour explorer davantage l'imagerie de la dynamique de croissance des vaisseaux sanguins et le remodelage, cependant, le modèle d'autres animaux comme le poisson-zèbre avec des vaisseaux sanguins marqué par fluorescence est utile pour imagerie time-lapse de la vascularisation in vivo à haute résolution.

Whole montage de microscopie confocale à l'étiquetage par des marqueurs vasculaires multiples nous ont permis d'image et le sang des cellules endothéliales lymphatiques, et leurs voisins, y compris les cellules musculaires lisses et des péricytes dans les peaux. En plus de l'anticorps marqueurs vasculaires (tableau 2), les anticorps pour les produits de gène rapporteur (la protéine β-galactosidase, β-gal et vert fluo, la GFP, le tableau 2) qui récapitulent le profil d'expression de gènes endogènes de votre intérêt peuvent être utilisés. Par exemple, nous avons utilisé la peau des membres antérieurs d'embryons porteurs rapporteur lacZ ciblé à l'ephrinB2 (Wang et al., 1998) ou EphB4 locus (Gerety et al., 1999), qui fournit un indicateur histochimique de ephrinB2 ou EphB4. EphrinB2, un ligand transmembranaire, est exprimé par les artères, mais pas les veines, tandis que son récepteur, la tyrosine kinase EphB4 est préférentiellement exprimé par les veines (Wang et al., 1998). Whole-Mont analyse immunohistochimique de peaux de membre antérieur du E15.5 ephrinB2 ^{lacZ / +} ou EphB4 ^{lacZ /} embryons hétérozygotes ⁺ a révélé que les nerfs sensoriels périphériques associés préférentiellement avec les artères (Mukouyama et al. 2002). Ces souris sont disponibles dans le laboratoire Jackson (Efnb2 ^tm1And / J: photos # 006039, EphB4 ^tm1And / J: photos # 006044).

L'étude des différentes étapes de ces systèmes vasculaires révèle la dynamique cellulaire de l'angiogenèse, y compris vasculaires ramification artérielle / veineuse différenciation, le développement des vaisseaux lymphatiques et des muscles lisses / péricytes de couverture dans la peau des membres en développement. Par E13.5, primitif plexus capillaire a été établi dans la peau des membres, mais aucune association entre les nerfs sensoriels et les vaisseaux sanguins a été observée. Par E14.5, remodelage vasculaire survenu et le nerf associée à remodelée vaisseaux ramifiés, qui expriment des marqueurs des cellules endothéliales artérielles et ont αSMA ⁺ des cellules musculaires lisses (Mukouyama et al. 2002). Les études génétiques suggèrent que les nerfs sensoriels périphériques fournir un modèle pour déterminer les schémas de branchement des vaisseaux sanguins artériels et la différenciation (Mukouyama et al. 2002). L'analyse de nerf-VEGF-A mutants conditionnels ont révélé que les nerfs issus du VEGF-A est nécessaire à la différenciation artérielle dans la peau des membres vasculaire (Mukouyama et al. 2005). Nos résultats ont également montré que le nerf-VEGF-A mutants conditionnels présentent moins de troubles de la vasculo-nerveux alignement, indiquant l'implication de facteurs angiogéniques (s) supplémentaire. Cela suggère que le modèle vascularisation cutanée membres nous permet d'étudier les différents mécanismes qui contrôlent la différenciation des artères et des motifs vasculaires branchement. Par ailleurs, les contrôles de différenciation veineux et la structuration de navire veineuse et lymphatique branchement reste encore sans réponse.

Materials

Antibodies Pan-endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1 PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2 Arterial endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution Venous endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution Lymphatic endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution Smooth muscle cell/pericyte marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6 NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution Antibodies forGFP reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution Antibodies for LacZ reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution Antibodies for peripheral axon Antibody Species Company Catalogue # Working condition 2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution Antibodies for migrating Schwann cells BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution (P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.