Summary
我们介绍整个安装的免疫组织化学和激光扫描共聚焦显微镜分析复杂的小鼠胚胎肢体皮肤血管网的形成多个标签。
Abstract
全安装整个血管成像的免疫组织化学分析的关键是了解分支形态发生的细胞机制。我们已经开发出患肢皮肤血管的模型来研究血管发展，其中一个预先存在的原始毛细血管丛是一个层次的分支血管网络重组。全安装多个标签的共聚焦显微镜允许以及完整的血管内皮细胞，周细胞和平滑肌细胞的细胞成分，包括使用特定的荧光标记，强大的成像。这个患肢皮肤血管模型与遗传研究进展，更好地了解血管的发展和图案的分子机制。患肢皮肤血管模型已被用于研究的分化和图案动脉末梢神经如何提供一个空间模板。此视频文章介绍了一个简单而强大的协议染色完整的血管与血管特异性抗体和荧光抗体，这是适用于我们能够遵循的血管发育过程中的吻合血管的胚胎器官。
Protocol
1。收集小鼠胚胎肢体皮肤（E13.5〜E17.5）
- 安乐死插入女性的批准程序。根据我们批准的动物协议，女性安乐死的CO 2曝光，然后由颈椎脱位保证。奠定其吸水纸巾上的动物和彻底浸泡在70％乙醇/ H 2 O从挤压瓶。
- 解剖子宫的完整性和它放置在一个100 × 15毫米的Petri菜含有冰冷汉克斯“平衡盐溶液（HBSS）洗出的血液。
- 分离和解剖胚胎。从胚胎中取出非常薄的羊膜。
- （选配）35 × 10毫米培养皿解剖一个单一的胚胎，如果每个胚胎需要进行基因分型。解剖尾巴被转移到0.2 ml的PCR基因分型管。
- 切断胚胎的前肢和转让一环钳前肢成24个含有2毫升冰冷鲜在磷酸缓冲液（PBS）的4％多聚甲醛（PFA）以及板。
- 修复与前肢在4 ° C过夜温柔Nutator搅拌机混合。
- 翌日，删除的煤灰和温柔Nutator搅拌机混匀，室温5分钟2毫升的PBS清洗三次。
- 转让100％的甲醇（甲醇）的前肢和储存：-20 ° C酶的冰箱（临界温度控制和不带自动除霜功能冰柜）。初级抗体上市100％甲醇处理后1个工作表。
- 剥离过的皮肤用细镊子的前肢。患肢皮肤，脱水时，应该很容易从四肢分开。腹面朝上（掌侧）第一名的肢体。然后用细镊子，切开皮肤，如视频所示。下一步剖析围绕整个肢体，剥离皮肤无任何损害，轻轻地。
2。全安装肢体皮肤的免疫组化染色
- 于5ml聚丙烯圆底管肢体皮肤补充水分通过一系列甲醇/ PBT（PBS + 0.2％TRITON X - 100）（75％，50％，25％）每5分钟分级孵化。请注意，交换解决方案应小心，以避免损坏肢体皮肤。
- 洗两次在PBT 5分钟，轻轻混匀，室温Nutator搅拌机。
- 肢体皮肤座山羊血清/ PBS 0.2％TX100阻断山羊抗体的缓冲为10％或10％驴血清/ PBS 0.2％TX100封闭液驴二次抗体Nutator搅拌机上轻轻搅拌2小时室温。
- 将800μl的初级抗体封闭液中（在表中列出的适当稀释）（35 × 10毫米的培养皿中，并转移到2毫升-离心管一个环钳肢体皮肤10％山羊血清/ PBS 0.2 TX100％或10％驴血清/ PBS 0.2％TX100）。肢体皮肤温和Nutator搅拌机混合，在4 ° C过夜孵育。请注意，可以同时使用多个来自不同的物种（如鼠单克隆抗体+多克隆抗体）的初级抗体。
- 翌日，放入圆底5毫升聚丙烯管35 × 10毫米的培养皿和转让一环钳肢体皮肤与4毫升洗涤液（2％山羊血清/ PBS 0.2％TX100或2 ％驴血清/ PBS 0.2％TX100）。
- 洗为15分钟，轻轻混匀，室温Nutator搅拌机五倍。
- 放置在35 × 10毫米的培养皿中，并转移到2毫升-离心管一个环钳800μl封闭液中的抗体（10％山羊血清/ PBS 0.2％TX100或10％驴血清/肢体皮肤PBS 0.2％TX100）。通常情况下，我们使用从杰克逊ImmunoResearch（Cy3标记，Cy5的，1:300稀释）或Invitrogen公司的Alexa Fluor 488的Alexa Fluor 568的Alexa Fluor 633，1:250稀释的抗体。使用0.22μm的PVDF膜针头式过滤器，以消除二次抗体的聚合颗粒过滤器的二次抗体溶液。温柔Nutator搅拌机混匀，室温孵育1小时在黑暗中或用铝箔包裹的肢体皮肤。需要注意的是来自不同物种的不同荧光共轭抗体可以同时使用。
- 放置在一个35 × 10毫米的培养皿中，并转移到5毫升聚丙烯圆底管一环钳与洗涤缓冲液（2％山羊血清/ PBS 0.2％TX100或2％驴血清/ PBS4毫升肢体皮肤0.2％TX100）。在黑暗中或用铝箔轻柔混匀，室温Nutator搅拌机包裹15分钟洗净五倍。
- （针对核counterstaining股权）孵育洗涤液（2％山羊血清/ PBS 0.2％TX100或2％驴血清/ PBS 0.2％TX100）为- PRO - 3（Invitrogen公司的T36054毫升肢体皮肤，1:3000稀释），在黑暗中或铝金属箔与温柔Nutator搅拌机搅拌10分钟，在室温temperatu包裹重。然后，洗5分钟三次4毫升在黑暗中或包裹铝箔与柔和的混合上的洗涤液（2％山羊血清/ PBS TX100或2％驴血清/ PBS 0.2％0.2％TX100）在室温Nutator搅拌机。需要注意的是强大的和具体的核染色观察到PRO - 3，在一个特定的排放量（氦氖633 nm激发）。
3。安装肢体皮肤上滑动
- 广场上一个35 × 10毫米培养皿的肢体皮肤。粉尘，水晶，纤维从皮肤内使用低照明体视显微镜下用细镊子，以避免大量的照片漂白层中删除。
- 一环钳传输肢体皮肤粘连微观幻灯片。放置在幻灯片上（即对盖玻片）向上的内在卧层皮肤。扁平化的皮肤，仔细地用细镊子和删除结转洗衣机Kimwipe缓冲区。
- 在防褪色的安装媒体安装无气泡。我们使用25“X25”盖玻片。固化一个平坦的表面上（例如在黑暗中，样品安装使用延长黄金试剂在室温下放置过夜在黑暗中观看前）。长期储存，密封盖玻片的幻灯片和储存在4 ° C。
4。共聚焦显微镜
- 设置适当的激光荧光团。我们用三个激光源，包括488nm（氩气的Alexa Fluor 488和GFP），561nm的DPSS的Alexa Fluor 568和Cy3标记和氦氖633纳米（的Alexa Fluor 633，Cy5和到临3）Leica TCS SP5的共聚焦显微镜。
- 使用顺序扫描工具，以避免或减少串扰两倍或三倍染色样本在所有染料中，将在同一时间兴奋。在连续扫描模式，图像将被记录在一个顺序。
- 更多关于激光激发荧光染料和一般的信息可能建立在“共聚焦显微镜的生物学家”希布斯（2004）
5。代表性的成果
全安装三重标签的共聚焦immnofluorescence显微镜E15.5小鼠前肢在皮肤泛内皮细胞标记抗体的PECAM - 1（图1A - C，D蓝色），神经丝标记2H3（图1A绿色），平滑肌细胞标记αSMA（图1A，B红）显示模式的特点αSMA+动脉分支，与肢体皮肤2H3 +末梢神经保持一致。除了血管分支，这个四肢皮肤血管模型是用来研究淋巴管分支使用的抗体，淋巴管内皮细胞标志物LYVE - 1（图1D，E红色）和Neuropilin2（NRP2）（图1D，F绿图案）。
图1（AC）动脉配合在胚胎肢体皮肤的末梢神经。全安装三重标签的共聚焦immnofluorescence显微镜与PECAM - 1（交流，蓝）的神经丝蛋白标记2H3（绿色），和平滑肌细胞标记αSMA（A和B，红泛内皮细胞标记抗体）所示。在E15.5，2H3 +末梢神经（空心箭头）副动脉（箭头），αSMA覆盖+平滑肌细胞。 （DF）的淋巴管在胚胎肢体皮肤血管。三重标签的共聚焦immnofluorescence显微镜与泛内皮细胞标记抗体PECAM - 1（深蓝色），淋巴管内皮细胞标志物LYVE - 1（D和E，红）和Neuropilin2（NRP2）（D和F，绿色）所示。淋巴管是由两个LYVE - 1和NRP2可视化，而LYVE - 1是由巨噬细胞（开放箭头）的一个子集表达。比例尺：100μm的。
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Discussion
血管系统是胚胎发育过程中以及在成人器官维护和生殖功能的器官发育的关键，因为它提供充足的氧气和养分的器官。适当的血管网，以及建立与血管生成的复杂和多步既存的毛细血管网，是具有高度支化结构和层次结构重组的过程。虽然许多作品已被证明在这些过程中涉及的各种分子，它没有明确如何机关或者其组件提供的信号，以促进血管发展的循序渐进的过程，包括内皮分化和血管分支的图案。为了解决这个问题，我们能够遵循的血管发育过程中的适当的吻合血管的器官是必需的。增益功能和丧失功能的基因操作的肢体皮肤与血管模型，使高分辨率血管发育分析。
我们在这里描述一个详细的协议，包括解剖小鼠胚胎前肢，整个安装免疫组织化学染色和共聚焦显微镜，是经常在我们的实验室用来分析肢体皮肤的血管生成和淋巴管。该协议提供的可重复性的结果早期以及晚期胚胎肢体皮肤很容易由共聚焦显微镜成像和完整的血管。它也适用于成年耳皮肤血管（YM和K珀金斯，未发表）。为了进一步探讨血管生长和重塑的动态成 像，然而，像斑马鱼与荧光标记的血管其他动物模型是很有用的时间推移在体内具有高分辨率血管成像的。
全安装多个标签血管标记共聚焦显微镜允许我们形象的血液和淋巴管内皮细胞，平滑肌细胞和周细胞在皮肤包括他们的邻居。此外血管标记抗体（表2），报告基因（β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白，GFP，表2）重述你感兴趣的内源性基因表达模式的抗体可以使用。例如，我们用携带lacZ报告有针对性地ephrinB2（王等人，1998年）或EphB4轨迹（Gerety 等 ，1999），它提供了一个组织化学ephrinB2或EphB4指标的胚胎前肢的皮肤。 EphrinB2，跨膜配体，是由动脉，但不脉，而其受体表达，酪氨酸激酶EphB4表达脉（ 王等人 ，1998年） 。全安装在E15.5 / lacZ的 ephrinB2 +或/ lacZ的 EphB4 +杂合子胚的前肢皮肤的免疫组织化学分析显示，末梢感觉神经与动脉血管优先（Mukouyama等，2002 ）。这些老鼠是在杰克逊实验室（Efnb2 tm1And / J：＃006039股票，Ephb4 tm1And / J：股票＃006044）。
这些血管系统的不同阶段的研究揭示了血管生成的包括分支血管，动脉/静脉分化，淋巴管的发展和平滑肌/周细胞覆盖在发展中国家肢体皮肤细胞动力学。 E13.5，原始毛细血管丛成立于患肢皮肤，但感觉神经和血管之间没有任何关联。 E14.5，发生血管重塑与改造的分支血管，表达动脉内皮细胞标志物和有αSMA+平滑肌细胞（Mukouyama等人，2002年）相关的神经。遗传研究表明，外周感觉神经提供一个确定的血管分支模式和动脉分化的模板（Mukouyama等 ，2002 ）。神经VEGF - A有条件的突变体的分析结果显示，神经，衍生血管内皮生长因子- A是在肢体皮肤血管的动脉分化（Mukouyama等， 2005）。我们的研究结果也表明，神经VEGF - A有条件的突变体表现出较少的神经血管对齐的损害，表明额外的血管生成因子（S）的参与。这表明，四肢皮肤血管模型允许我们去研究不同的机制，控制动脉血管分支的分化和图案。此外，控制静脉分支血管的静脉和淋巴的分化和图案仍然要回答。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢与小鼠的繁殖和护理援助和实验室管理K.吉尔。也Mukoyama实验室成员的技术帮助表示感谢。经费是由美国卫生Naitonal研究所院内研究计划。
Materials
Antibodies Pan-endothelial cell marker
Arterial endothelial cell marker
Venous endothelial cell marker
Lymphatic endothelial cell marker
Smooth muscle cell/pericyte marker
Antibodies forGFP reporter
Antibodies for LacZ reporter
Antibodies for peripheral axon
Antibodies for migrating Schwann cells
(P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine. |
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References
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Molecular distinction and angiogenic interaction between embryonic arteries and veins revealed by ephrin-B2 and its receptor Eph-B4. Cell. 93, 741-753 (1998).
- Gerety, S. S., Wang, H. U., Chen, Z. F., Anderson, D. J. Symmetrical mutant phenotypes of the receptor EphB4 and its specific transmembrane ligand ephrin-B2 in cardiovascular development. Mol Cell. 4, 403-414 (1999).
