Whole-mount Immunohistochemische Analyse voor Embryonale Limb Skin vaatstelsel: een modelsysteem voor Vasculaire Vertakkingen Morphogenesis in Embryo Study

Summary

We introduceren een hele-mount immunohistochemie en laser scanning confocale microscopie met meerdere etikettering voor het analyseren van complexe vasculaire netwerk-vorming in de muis embryonale ledematen huid.

Abstract

Whole-mount immunohistochemische analyse voor de beeldvorming van de hele vasculatuur is cruciaal voor het begrijpen van de cellulaire mechanismen van vertakking morfogenese. We hebben de ledemaat huid vasculatuur model vasculaire ontwikkeling, waarbij een reeds bestaande primitieve capillaire plexus is omgevormd tot een hiërarchisch vertakte vasculaire netwerk te bestuderen. Whole-mount confocale microscopie met meerdere etikettering maakt voor robuuste beeldvorming van intacte bloedvaten evenals hun cellulaire componenten, waaronder endotheelcellen, pericyten en gladde spiercellen, met behulp van specifieke fluorescente merkers. Vooruitgang in dit onderdeel de huid vaatstelsel model met genetische studies hebben een beter begrip moleculaire mechanismen van vasculaire ontwikkeling en patroonvorming. De ledematen huid vasculatuur model is gebruikt om te bestuderen hoe perifere zenuwen een ruimtelijk model voor de differentiatie en patroonvorming van de slagaders. Deze video artikel beschrijft een eenvoudige en robuuste protocol om intact bloedvaten vlek met vasculaire specifieke antilichamen en fluorescente secundaire antilichamen, die van toepassing is voor de gevasculariseerd embryonale organen waar we in staat zijn om het proces van vasculaire ontwikkeling te volgen.

Protocol

1. Het verzamelen van muis embryonale Limb Skin (E13.5 ~ E17.5)

1. Euthanaseren aangesloten vrouwen door erkende procedure. Volgens onze goedgekeurde dieren protocol worden de vrouwtjes gedood door de CO ₂ belichting en vervolgens verzekerd door cervicale dislocatie. Leg het dier op haar absorberende papieren handdoek en grondig laat deze in 70% EtOH / H ₂ O uit een knijpfles.
2. Ontleden de baarmoeder intact en plaats deze in een 100 x 15 mm petrischaal met Balanced Salt ijskoude Hanks 'Solution (HBSS) uit te spoelen bloed.
3. Scheiden en ontleden van de embryo. Verwijder de zeer dunne amnion van het embryo.
4. (Optie) Prepareer een enkel embryo in een 35 x 10 mm petrischaal als elk embryo moet worden gegenotypeerd. Ontleed staart is overgebracht naar een 0,2 ml PCR-buis voor genotypering.
5. Snijd de voorpoten van de embryo en de overdracht voorpoten door een ring tang in 24 wells plaat met 2 ml ijskoude verse 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
6. Bevestig de voorpoten met zachte mengen op de Nutator Mixer bij 4 ° C gedurende de nacht.
7. Op de volgende dagen, verwijder de PFA en was drie keer voor 5 min in 2 ml PBS met zachte mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
8. Breng de voorpoten in 100% methanol (MeOH) en bewaar deze bij -20 ° C vriezer enzym (de vriezer met een kritische temperatuur controle en zonder automatische ontdooifunctie). Primaire antilichamen vermeld in tabel 1 het werk na de 100% MeOH behandeling.
9. Verwijder de huid van de voorpoot met fijne pincet. Limb huid, toen uitgedroogd, moet gemakkelijk los van de ledemaat. Eerste plaats de ledematen met ventrale zijde (handpalm zijde) naar boven gericht. Vervolgens met behulp van fijne pincet, snijd de huid zoals in de video. Volgende ontleden door het hele ledemaat, peeling van de huid af voorzichtig, zonder enige schade.

2. Whole-mount immunohistochemische kleuring van Limb Skins

1. Hydrateren van de ledematen huiden in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis door het incuberen van door de gesorteerde reeks van MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) gedurende 5 minuten elk. Merk op dat de uitwisseling van oplossingen moeten voorzichtig om te voorkomen dat schade aan de ledematen skins.
2. Was twee keer voor 5 min in PBT met zachte mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
3. Blokkeer de ledematen skins met ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2% TX100 blokkerende buffer voor de geit secundaire antilichamen of 10% Donkey serum / PBS +0.2% TX100 blokkerende buffer voor de ezel secundaire antilichamen gedurende 2 uur met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer op kamertemperatuur.
4. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 2ml-microcentrifugebuis met 800μl van primaire antilichamen (juiste verdunning zoals vermeld in de tabellen) in de blokkerende buffer (ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2 TX100% of 10% Donkey serum / PBS +0.2% TX100). Incubeer de ledematen huiden met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij 4 ° C gedurende de nacht. Merk op dat meerdere primaire antilichamen afgeleid van verschillende soorten (bijvoorbeeld rat monoklonaal antilichaam + konijn polyklonaal antilichaam) kunnen gelijktijdig worden gebruikt.
5. Op de volgende dag, plaatst u de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2 Donkey% serum / PBS +0.2% TX100).
6. Was vijf keer gedurende 15 minuten met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
7. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 2ml-microcentrifugebuis met 800μl van secundaire antilichamen in het blokkerende buffer (ofwel 10% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 10% Donkey serum / PBS +0,2% TX100). Normaal gesproken gebruiken we secundaire antilichamen uit Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 verdunningen) of Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 verdunning). Filter het secundaire antilichaam-oplossing met behulp van 0.22μm PVDF membraan spuit filters om geaggregeerde deeltjes van de secundaire antilichamen te verwijderen. Incubeer de ledematen skins in het donker of omwikkeld met aluminium folie gedurende 1 uur met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. Merk op dat verschillende fluorescerende geconjugeerd secundair antilichamen afgeleid van verschillende soorten kunnen gelijktijdig worden gebruikt.
8. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal en overdracht door een ring tang in 5 ml polypropyleen ronde bodem buis met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100). Was vijf keer gedurende 15 minuten in het donker of omwikkeld met aluminium folie met voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur.
9. (Optie voor tegenkleuring tegen de kern) Incubeer de ledematen huiden met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100) met To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 verdunning) in het donker of omwikkeld met aluminium folie gedurende 10 minuten met een voorzichtig mengen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur temperare. Daarna, was drie keer voor 5 min met 4 ml van de wasbuffer (ofwel 2% Geit serum / PBS +0.2% TX100 of 2% Donkey serum / PBS +0.2% TX100) in het donker of verpakt door aluminium folie met zachte mixen op de Nutator Mixer bij kamertemperatuur. Merk op dat sterke en specifieke kleuring voor de kernen is waargenomen voor To-pro-3 in een specifieke emissie (HeNe 633 nm excitatie).

3. Montage van de Limb Skins op dia

1. Plaats de ledemaat skins op een 35 x 10 mm petrischaal. Verwijderen stof, kristallen, vezels van de binnenste laag van de huid met behulp van fijne pincet onder de stereomicroscoop met een lage verlichting tot uitgebreide foto bleken te voorkomen.
2. Breng de ledematen skins om lijm microscopisch preparaat door een ring tang. Leg de huiden met de binnenste laag liggend naar boven op de dia (dwz naar dekglaasje). Platter de huiden zorgvuldig met fijn pincet en verwijder de carry-over wasbuffer door Kimwipe.
3. Monteren in anti-fade montage media zonder luchtbellen. We maken gebruik van 25 "x25" dekglaasje aan. Cure op een vlakke ondergrond in het donker (bijvoorbeeld de monsters bevestigd met Gold reagens ProLong worden 's nachts geplaatst in het donker bij kamertemperatuur voordat u deze bekijkt). Voor de lange-termijn opslag, sluit de dekglaasje aan de dia en bewaar bij 4 ° C.

4. Confocale microscopie

1. Opzetten van passende lasers voor fluoroforen. We maken gebruik van Leica TCS SP5 confocale microscoop met drie bronnen, waaronder laser-Argon 488nm (voor Alexa Fluor 488 en GFP), DPSS 561nm (voor Alexa Fluor 568 en Cy3) en HeNe 633nm (voor Alexa Fluor 633, Cy5 en To-Pro-3) .
2. Gebruik opeenvolgende scanner te voorkomen of te verminderen crosstalk in waarin alle kleurstoffen in dubbele of drievoudige-gekleurde monsters worden opgewonden tegelijk. In de sequentiële scan-modus worden beelden worden vastgelegd in een volgorde.
3. Meer algemene informatie over de fluorescente kleurstoffen en lasers voor excitatie kunnen worden opgericht "confocale microscopie voor biologen" door Hibbs (2004)

5. Representatieve resultaten

Whole-mount triple-label confocale microscopie immnofluorescence in de muis voorpoot huid E15.5 met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (Figuur 1A-C, D blauw), de neurofilament marker 2H3 (Figuur 1A groen), en de gladde spiercel marker αSMA (Figuur 1A, B rood) onthulde een karakteristiek patroon van vertakking αSMA ⁺ slagaders, in lijn met 2H3 ⁺ perifere zenuwen in de ledematen huid. Naast het bloedvat vertakking, is dit onderdeel skin vasculatuur model gebruikt om de patronen van lymfevat vertakkingen met behulp van antilichamen tegen het lymfatische endotheelcel marker LYVE-1 (figuur 1D, E rood) en Neuropilin2 (NRP2) (figuur 1D, F groene studie ).

Figuur 1. (AC) Slagaders lijn te brengen met perifere zenuwen in de embryonale ledematen huid. Whole-mount triple-label confocale microscopie immnofluorescence met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (AC, blauw), de neurofilament marker 2H3 (A, groen), en de gladde spiercellen marker αSMA (A en B, rood ) is weergegeven. Bij E15.5, 2H3 ⁺ perifere zenuwen (open pijlen) associëren met slagaders (pijlpunten), die vallen onder αSMA ⁺ gladde spiercellen. (DF) Lymfatische bloedvaten in de embryonale ledematen huid. Triple-label confocale microscopie immnofluorescence met antilichamen tegen de pan-endotheliale cel marker PECAM-1 (D, blauw), de lymfatische endotheelcel marker LYVE-1 (D en E, rood) en Neuropilin2 (NRP2) (D en F, groen ) is weergegeven. Lymfevaten worden gevisualiseerd door zowel LYVE-1 en NRP2, terwijl LYVE-1 wordt ook uitgedrukt door een subset van macrofagen (open pijlpunten). Schaal bar: 100 urn.

Discussion

Het vasculaire systeem is cruciaal voor orgel ontwikkeling tijdens de embryogenese, alsook voor orgel onderhoud en reproductieve functies in de volwassenen, want het levert voldoende zuurstof en voedingsstoffen naar de organen. Een goede vasculaire netwerk is goed opgezet met complexe en multi-step processen angiogenese waarbij reeds bestaande capillaire netwerk wordt gereorganiseerd met zeer vertakte en hiërarchische structuren. Hoewel talrijke werken is aangetoond dat een verscheidenheid van moleculen is betrokken bij deze processen, is het niet duidelijk hoe organen of hun componenten de signalen aan de stapsgewijze proces van vasculaire ontwikkeling, inclusief endotheel differentiatie en patroonvorming van vasculaire vertakking te bevorderen bieden. Om deze vraag, zijn geschikt gevasculariseerd organen, waar we in staat zijn om het proces van vasculaire ontwikkeling te volgen vereist. De ledematen huid bloedvaten model met gain-of-functie en verlies-van-functie genetische manipulaties maakt hoge-resolutie analyse van de vasculaire ontwikkeling.

We beschrijven hier een gedetailleerd protocol met dissectie van embryonale muis voorpoten, hele-mount immunohistochemische kleuring en confocale microscopie die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om ledematen huid angiogenese en lymfangiogenese te analyseren. Het protocol voorziet in reproduceerbare resultaten en bloedvaten intact voor zowel vroege als late embryonale ledematen huid is eenvoudig in beeld gebracht door confocale microscopie. Het is ook van toepassing voor volwassen oor huid vaatstelsel (YM en K. Perkins, ongepubliceerd). Verder te verkennen de beeldvorming van de dynamiek van de groei van bloedvaten en remodeling, echter andere diermodel zoals zebravissen met fluorescent gelabelde bloedvaten nuttig is voor time-lapse beeldvorming van de bloedvaten in vivo met een hoge resolutie.

Whole-mount confocale microscopie met meerdere etikettering door vasculaire markers ons toegestaan ​​om beeld bloed-en lymfatische endotheelcellen, en hun buren waaronder gladde spiercellen en pericyten in de huid. In aanvulling op de vasculaire marker antilichamen (tabel 2), kunnen antilichamen voor de reporter-gen-producten (β-galactosidase, β-gal en groen fluorescerend eiwit, GFP, tabel 2) dat de expressie patroon van endogene genen van uw interesse herhalen worden gebruikt. Bijvoorbeeld, gebruikten we voorpoot huid van embryo's met lacZ reporter gericht op de ephrinB2 (Wang et al.., 1998) of EphB4 locus (Gerety et al.., 1999), die een histochemische indicator van ephrinB2 of EphB4 biedt. EphrinB2, een transmembraan ligand, wordt uitgedrukt door de slagaders, maar niet aderen, terwijl de receptor, is de tyrosine kinase EphB4 bij voorkeur uitgedrukt door aderen (Wang et al.., 1998). Whole-mount immunohistochemische analyse in voorpoot huiden van E15.5 ephrinB2 ^{lacZ / +} of EphB4 ^{lacZ / +} heterozygoot embryo's is gebleken dat perifere sensorische zenuwen bij voorkeur geassocieerd met arteriële vaten (Mukouyama et al.. 2002). Deze muizen zijn beschikbaar in de Jackson Laboratory (Efnb2 ^tm1And / J: voorraad # 006039, Ephb4 ^tm1And / J: voorraad # 006044).

De studie van de verschillende stadia van deze vasculaire systemen onthult de cellulaire dynamiek van angiogenese met inbegrip van vasculaire vertakking, arteriële / veneuze differentiatie, lymfatische ontwikkeling van de bloedvaten en het gladde spierweefsel / pericyte dekking in de zich ontwikkelende ledematen huid. Door E13.5, was primitief capillaire plexus gevestigd in de ledematen huid, maar geen verband tussen de zintuiglijke zenuwen en bloedvaten waargenomen. Door E14.5, vasculaire remodellering opgetreden en zenuwen verbonden met vernieuwd vertakte schepen, die arteriële endotheelcellen markers te uiten en hebben αSMA ⁺ gladde spiercellen (Mukouyama et al.. 2002). Genetische studies suggereren dat perifere sensorische zenuwen een sjabloon voor het bepalen van het bloedvat vertakking patronen en arteriële differentiatie (Mukouyama et al.. 2002) te geven. De analyse van zenuw-VEGF-A voorwaardelijke mutanten toonde aan dat zenuw-afgeleide VEGF-A is vereist voor arteriële differentiatie in de ledematen huid vaatstelsel (Mukouyama et al.. 2005). Onze resultaten toonden ook aan dat de zenuw-VEGF-A voorwaardelijke mutanten minder aantasting van de zenuw-schip lijn vertonen, met vermelding van de betrokkenheid van extra angiogene factor (en). Dit suggereert dat de ledemaat huid vaatstelsel model stelt ons in staat om te studeren verschillende mechanismen die arteriële differentiatie en patroonvorming van de vasculaire vertakking controle. Bovendien, wat controles veneuze differentiatie en patroonvorming van de veneuze en lymfatische schip vertakking nog moet worden beantwoord.

Materials

Antibodies Pan-endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1 PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2 Arterial endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution Venous endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution Lymphatic endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution Smooth muscle cell/pericyte marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6 NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution Antibodies forGFP reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution Antibodies for LacZ reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution Antibodies for peripheral axon Antibody Species Company Catalogue # Working condition 2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution Antibodies for migrating Schwann cells BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution (P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.