Whole-mount Immunhistochemische Analyse für Embryonale Limb Haut Gefäßsystem: ein Modellsystem zur Vascular Branching Morphogenese in Embryo-Studie

Summary

Wir stellen Ihnen eine ganze-mount Immunhistochemie und konfokaler mit mehreren Kennzeichnung für die Analyse von komplizierten Gefäßnetz Bildung in embryonalen Maus Gliedmaßen Haut.

Abstract

Whole-mount immunhistochemische Analyse zur Abbildung des gesamten Gefäßsystem ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis der zellulären Mechanismen der Verzweigung Morphogenese. Wir haben das Bein Haut Gefäßsystem Modell der vaskulären Entwicklung, in der eine bereits bestehende primitive Kapillarplexus in eine hierarchisch verzweigten Gefäßnetz reorganisiert wird Studie entwickelt. Whole-mount konfokalen Mikroskopie mit mehreren Kennzeichnung ermöglicht robuste Bildgebung von intakten Blutgefäßen sowie deren zelluläre Komponenten, einschließlich Endothelzellen, Perizyten und glatte Muskelzellen, mit spezifischen fluoreszierenden Marker. Advances in diesem Teil der Haut Gefäßsystem Modell mit genetischen Studien haben ein besseres Verständnis molekularer Mechanismen der vaskulären Entwicklung und Strukturierung. Das Glied Haut Gefäßsystem Modell wurde verwendet, zu untersuchen, wie peripheren Nerven eine räumliche Vorlage liefern für die Differenzierung und Strukturierung von Arterien. Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache und robuste Protokoll zu intakten Blutgefäßen mit vaskulären spezifische Antikörper und fluoreszierende Sekundärantikörper werden, die für vaskularisierte embryonale Organe, wo wir in der Lage sind, den Prozess der vaskulären Entwicklung folgen Fleck.

Protocol

1. Sammeln embryonalen Maus-Limb Skin (E13.5 ~ E17.5)

1. Euthanize gesteckt Weibchen durch zugelassene Verfahren. Nach unseren zugelassenen Tier-Protokoll sind die Weibchen von CO ₂ Belastung eingeschläfert und dann durch Genickbruch gewährleistet. Legen Sie das Tier auf seinen saugfähigen Papiertuch und legen Sie ihn gründlich in 70% EtOH / H ₂ O aus einer Spritzflasche.
2. Präparieren Sie die Gebärmutter intakt und legen Sie sie in einem 100 x 15 mm Petrischale mit eiskaltem Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) zu waschen Blut.
3. Separate und sezieren des Embryos. Entfernen Sie die sehr dünne Amnion aus dem Embryo.
4. (Option) Dissect eines einzigen Embryos in einem 35 x 10 mm Petrischale, wenn jeder Embryo muss genotypisiert werden. Dissected Schwanz ist ein 0,2 ml PCR-Röhrchen für die Genotypisierung übertragen.
5. Schneiden Sie die Vorderbeine des Embryos und Transfer Vorderbeine durch einen Ring Pinzette in 24-Well-Platte mit 2 ml eiskaltem frischen 4% Paraformaldehyd (PFA) in Phosphatpuffer Saline (PBS).
6. Fix die Vorderbeine mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei 4 ° C über Nacht.
7. Am folgenden Tag, entfernen Sie die PFA und waschen dreimal für 5 min in 2 ml PBS mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
8. Übertragen Sie die Vorderbeine in 100% Methanol (MeOH) und speichert sie bei -20 ° C Enzym Gefrierschrank (Gefrierschrank mit kritischen Temperatur-Steuerung und ohne automatische Abtauung). Primärantikörper in Tabelle 1 der Arbeit nach der 100% MeOH Behandlung aufgeführt.
9. Peel off Haut aus dem Vorderbein mit feinen Pinzette. Limb Haut, wenn entwässert, sollte einfach zu trennen von der Extremität. Der erste Platz der Extremität mit Bauchseite (Handfläche) nach oben. Dann mit feinen Pinzetten, schneiden Sie die Haut wie im Video gezeigt. Next um den gesamten Leib sezieren, Peeling die Haut sanft, ohne Schäden.

2. Whole-mount immunhistochemische Färbung von Limb Skins

1. Rehydrieren die Extremität Skins in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr durch Inkubation durch die abgestufte Reihe von MeOH / PBT (PBS + 0,2% Triton X-100) (75%, 50%, 25%) für jeweils 5 min. Beachten Sie, dass der Austausch-Lösungen sollten vorsichtig sein, um eine Beschädigung des Körpers skins.
2. Zweimal waschen für 5 min in PBT mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
3. Blockieren Sie die Gliedmaßen Skins entweder mit 10% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 Blockierungspuffer für Ziege Sekundärantikörper oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100 Blockierungspuffer für Esel Sekundärantikörper für 2 Stunden unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
4. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 2ml-Reaktionsgefäß mit 800μl des primären Antikörpern (entsprechender Verdünnung in den Tabellen aufgeführt) in den Blocking-Puffer (entweder 10% Ziegenserum / PBS + 0,2 % TX100 oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). Inkubieren der Extremität Skins mit sanftem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei 4 ° C über Nacht. Beachten Sie, dass mehrere primäre Antikörper aus verschiedenen Spezies (zB Ratte monoklonale Antikörper + polyklonalen Kaninchen-Antikörper) abgeleitet gleichzeitig genutzt werden können.
5. Am folgenden Tag, Ort der Extremität Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2 % Donkey Serum / PBS +0,2% TX100).
6. Wash fünfmal für 15 min unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
7. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 2ml-Reaktionsgefäß mit 800μl der Sekundärantikörper in den Blocking-Puffer (entweder 10% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 10% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). In der Regel verwenden wir Sekundärantikörper von Jackson ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 Verdünnungen) oder Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 Verdünnung). Filtern Sie die sekundären Antikörper-Lösung mit 0,22 &mgr; m PVDF-Membran Spritzenfilter, um aggregierte Partikel der sekundären Antikörper zu entfernen. Inkubieren der Extremität Skins im Dunkeln oder mit Alufolie umwickelt für 1 Stunde mit leichtem Rühren auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass verschiedene fluoreszierende konjugierte sekundäre Antikörper von verschiedenen Spezies abgeleitet gleichzeitig genutzt werden können.
8. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale und Transfer von einem Ring Pinzette in 5ml Polypropylen mit rundem Boden Rohr mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100). Wash fünfmal für 15 min im Dunkeln oder umwickelt mit Alufolie mit leichtem Rühren auf dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur.
9. (Option für die Gegenfärbung gegen Kern) Inkubieren der Extremität Skins mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100) mit To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 Verdünnung) in der Dunkelheit oder umwickelt mit Alufolie für 10 min unter leichtem Mischen auf dem Kolbenpendel Mixer bei Zimmertemperatur Temre. Dann waschen dreimal 5 min mit 4 ml Waschpuffer (entweder 2% Ziegenserum / PBS +0,2% TX100 oder 2% Donkey Serum / PBS +0,2% TX100) im Dunkeln oder durch Aluminium-Folie mit leichtem Rühren auf gewickelt dem Kolbenpendel Mixer bei Raumtemperatur. Beachten Sie, dass starke und spezifische Färbung für Keime für Um-pro-3 ist in einer spezifischen Emission (HeNe 633 nm Anregung) beobachtet.

3. Montage des Limb Skins auf Slide

1. Legen Sie das Bein Skins auf einem 35 x 10 mm Petrischale. Entfernen Sie Staub, Kristallen, Fasern von der inneren Schicht der Haut mit feinen Pinzetten unter dem Stereomikroskop mit geringer Beleuchtung auf umfangreiche Foto Bleichen zu vermeiden.
2. Übertragen Sie die Extremitäten Skins, um Klebstoff Objektträger durch einen Ring Pinzette. Legen Sie die Haut mit der inneren Schicht liegt oben auf der Folie (dh in Richtung Deckglas). Flatten die Felle sorgfältig mit feinen Pinzette und entfernen carry-over Waschpuffer durch Kimwipe.
3. Berg in anti-fade Montage Medien ohne Luftblasen. Wir verwenden 25 "x25" Deckglas. Cure auf einer ebenen Fläche in der Dunkelheit (zB montiert die Proben unter Verwendung ProLong Gold-Reagenz werden über Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur vorgelegt, bevor viewing). Für die langfristige Lagerung, Deckglasränder, um die Folie und lagern bei 4 ° C.

4. Konfokale Mikroskopie

1. Richten Sie entsprechende Laser für Fluorophore. Wir verwenden Leica TCS SP5 konfokalen Mikroskop mit drei Laserquellen mit Argon 488nm (für Alexa Fluor 488 und GFP), DPSS 561nm (für Alexa Fluor 568 und Cy3) und HeNe 633nm (für Alexa Fluor 633, Cy5 und To-Pro-3) .
2. Verwenden sequenziellen Scan-Tool zu vermeiden oder zu vermindern das Übersprechen in dem alle Farbstoffe in Doppel-oder Dreifach-gefärbten Proben gleichzeitig begeistert sein. In der sequentiellen Scan-Modus, werden die Bilder in einer sequenziellen Reihenfolge aufgezeichnet werden.
3. Weitere allgemeine Informationen über Fluoreszenzfarbstoffe und Laser für die Anregung kann in "Die konfokale Mikroskopie für Biologen" gegründet werden, indem Hibbs (2004)

5. Repräsentative Ergebnisse

Whole-mount Triple-Label konfokalen Mikroskopie in immnofluorescence Maus forelimb Haut an E15.5 mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (Abbildung 1A-C, D blau), die Neurofilament Marker 2H3 (Abbildung 1A grün) und die glatte Muskelzelle Marker αSMA (Abbildung 1A, B rot) zeigte eine charakteristische Verzweigungsmuster αSMA ⁺ Arterien, mit 2H3 ⁺ peripheren Nerven in den Gliedmaßen Haut ausgerichtet. Neben der Blutgefäße Verzweigungen, ist dieser Teil der Haut Gefäßsystem Modell zur Strukturierung von Lymphgefäßsystem Verzweigung mit Antikörpern gegen das lymphatische Endothel-Zell-Marker LYVE-1 (Abb. 1D, E rot) und Neuropilin2 (NRP2) (Abbildung 1D-, F grün-Studie ).

Abbildung 1. (AC) Arterien align mit peripheren Nerven in der embryonalen Körpers Haut. Whole-mount Triple-Label konfokalen Mikroskopie immnofluorescence mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (AC, blau), die Neurofilament Marker 2H3 (A, grün) und der glatten Muskelzellen Marker αSMA (A und B, rot ) gezeigt. Am E15.5, 2H3 ⁺ peripheren Nerven (offene Pfeile) assoziieren mit Arterien (Pfeilspitzen), die durch αSMA abgedeckt werden ⁺ glatten Muskelzellen. (DF) Lymphgefäßsystems in der embryonalen Körpers Haut. Triple-Label konfokalen Mikroskopie immnofluorescence mit Antikörpern gegen die pan-Endothelzell-Marker PECAM-1 (D, blau), des lymphatischen Endothelzellen Marker LYVE-1 (D und E, rot) und Neuropilin2 (NRP2) (D und F, grün ) gezeigt. Lymphgefäße werden visualisiert sowohl LYVE-1 und NRP2, während LYVE-1 wird auch durch eine Teilmenge von Makrophagen (offene Pfeilspitzen) ausgedrückt. Maßstab: 100 um.

Discussion

Das Gefäßsystem ist entscheidend für die Entwicklung der Organe während der Embryonalentwicklung sowie für Orgel Wartung und reproduktiven Funktionen in die Erwachsenen, weil es genügend Sauerstoff und Nährstoffe zu den Organen liefert. Proper Gefäßnetz ist mit komplexen und mehrstufigen Verfahren durch Angiogenese, in dem bereits bestehenden Netz von Kapillaren mit stark verzweigten und hierarchischen Strukturen neu organisiert ist gut etabliert. Obwohl zahlreiche Arbeiten haben gezeigt worden, dass eine Vielzahl von Molekülen in diese Prozesse involviert ist, war es nicht klar, wie Organe oder deren Komponenten die Signale zu den stufenweisen Prozess der vaskulären Entwicklung, einschließlich der endothelialen Differenzierung und Strukturierung von vaskulären Verzweigung zu fördern sind. Um diese Frage zu beantworten, werden entsprechende vaskularisierten Organen, wo wir in der Lage sind, den Prozess der vaskulären Entwicklung folgen müssen. Das Glied Haut Gefäßsystem Modell mit Gain-of-function und loss-of-function genetische Manipulationen ermöglicht hochauflösende Analyse von vaskulären Entwicklung.

Wir beschreiben hier ein ausführliches Protokoll einschließlich Dissektion der embryonalen Maus Vorderbeine, ganze-mount immunhistochemische Färbung und konfokale Mikroskopie, die routinemäßig in unserem Labor wird verwendet, um Gliedmaßen Haut Angiogenese und Lymphangiogenese analysieren. Das Protokoll sieht reproduzierbare Ergebnisse und intakten Gefäßsystem für frühe als auch späte embryonale Gliedmaßen Haut ist leicht durch konfokale Mikroskopie abgebildet. Es ist auch für erwachsene Ohren Haut Gefäßsystem (YM und K. Perkins, unveröffentlicht). Zur weiteren Untersuchung der Abbildung der Dynamik der das Wachstum von Blutgefäßen und Umbau, aber auch andere Tier-Modell wie Zebrafisch mit fluoreszenzmarkierten Blutgefäßen nützlich für Zeitraffer-Bildgebung des Gefäßsystems in vivo mit hoher Auflösung.

Whole-mount konfokalen Mikroskopie mit mehreren Kennzeichnung durch vaskuläre Marker erlaubt es uns, Bild Blut-und lymphatischen Endothelzellen und ihren Nachbarn, einschließlich glatten Muskelzellen und Perizyten in den Schalen. Zusätzlich zu den vaskulären Marker-Antikörper (Tabelle 2) können Antikörper für Reportergenprodukte (β-Galactosidase, β-gal und grün fluoreszierendes Protein, GFP, Tabelle 2) dass die Expression der endogenen Gene Ihr Interesse rekapitulieren verwendet werden. Zum Beispiel haben wir forelimb Haut von Embryonen mit lacZ Reporter gezielt auf die EphrinB2 (Wang et al., 1998) oder EphB4 Locus (Gerety et al., 1999), die eine histochemische Indikator für EphrinB2 oder EphB4 bietet. EphrinB2, eine Transmembran-Liganden, die von Arterien, nicht aber Venen, während dessen Rezeptor exprimiert wird, ist der Tyrosinkinase-EphB4 bevorzugt von Venen (Wang et al., 1998) zum Ausdruck gebracht. Whole-mount immunhistochemische Analyse in forelimb Felle von E15.5 EphrinB2 ^{lacZ / +} oder EphB4 ^{lacZ / +} heterozygoten Embryonen ergeben, dass peripheren sensorischen Nerven bevorzugt mit arteriellen Blutgefäßen assoziiert (Mukouyama et al. 2002). Diese Mäuse sind in der Jackson Laboratory (Efnb2 ^tm1And / J: Stock # 006039, EphB4 ^tm1And / J: Stock # 006044).

Das Studium der verschiedenen Phasen dieser Gefäßsystems zeigt die zelluläre Dynamik der Angiogenese einschließlich vaskulärer Verzweigung, arterielle / venöse Differenzierung Lymphgefäßsystem Entwicklung und der glatten Muskulatur / Perizyten Berichterstattung in den Entwicklungsländern Gliedmaßen Haut. Durch E13.5, war primitiv Kapillarplexus in der Extremität Haut etabliert, aber keinen Zusammenhang zwischen sensorischen Nerven und Blutgefäßen beobachtet wurde. Durch E14.5 traten vaskuläre Remodeling und Nerven mit umgebauten verzweigte Gefäße, die arterielle Endothelzellmarkern ausdrücken und haben αSMA ⁺ glatten Muskelzellen (Mukouyama et al. 2002). Genetische Studien deuten darauf hin, dass peripheren sensorischen Nerven eine Vorlage für die Bestimmung des Blutgefäßes Verzweigungsmuster und arterielle Differenzierung (Mukouyama et al. 2002) geben. Die Analyse der Nerven-VEGF-A bedingte Mutanten ergab, dass Nerven-derived VEGF-A für die arterielle Differenzierung in der Extremität Haut Gefäßsystem erforderlich ist (Mukouyama et al. 2005). Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass der Nerv-VEGF-A bedingte Mutanten weniger Beeinträchtigung der Nerven-Gefäß-Ausrichtung aufweisen, unter Angabe der Beteiligung weiterer angiogenen Faktor (s). Dies deutet darauf hin, dass die Extremität Haut Gefäßsystem Modell uns auf verschiedene Mechanismen, die arterielle Differenzierung und Strukturierung von vaskulären Verzweigungen Kontroll-Studie ermöglicht. Darüber hinaus steuert, was venösen Differenzierung und Strukturierung von venösen und lymphatischen Gefäß Verzweigung bleibt noch zu beantworten.

Materials

Antibodies Pan-endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1 PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2 Arterial endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution Venous endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution Lymphatic endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution Smooth muscle cell/pericyte marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6 NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution Antibodies forGFP reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution Antibodies for LacZ reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution Antibodies for peripheral axon Antibody Species Company Catalogue # Working condition 2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution Antibodies for migrating Schwann cells BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution (P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.