Whole-mount עבור ניתוח immunohistochemical vasculature לימב עובריים עור: מערכת מודל לחקר המורפוגנזה מסעף דם בעובר

Summary

אנחנו מציגים אימונוהיסטוכימיה כל הר לייזר מיקרוסקופיית confocal עם תיוג מרובים לניתוח רשת סבוכה היווצרות כלי דם בעור איבר עכבר עובריים.

Abstract

Whole-Mount ניתוח immunohistochemical הדמיה vasculature כולו מרכזי להבנת מנגנוני הסלולר של הסתעפות המורפוגנזה. פיתחנו את העור איבר vasculature מודל ללמוד פיתוח כלי הדם שבו קיימים מקלעת נימי פרימיטיבי הוא ארגן מחדש לתוך רשת מסועפת של כלי הדם הירארכי. Whole-Mount מיקרוסקופיה confocal עם תיוג מרובים מאפשר הדמיה החזקה של כלי הדם ללא פגע, כמו גם מרכיבים תאיים שלהם כולל תאים, pericytes אנדותל ותאי שריר חלק, באמצעות סמנים ניאון ספציפיים. ההתקדמות מודל זה עור vasculature איבר עם מחקרים גנטיים השתפרו הבנה של המנגנונים המולקולריים דפוסים התפתחות כלי הדם. העור האיבר מודל vasculature נעשה שימוש כדי ללמוד איך העצבים ההיקפיים לספק תבנית מרחבית על בידול ועל דפוסים של העורקים. מאמר זה מתאר וידאו פרוטוקול פשוט חזקים כדי כתם הדם שלם עם נוגדנים ספציפיים כלי הדם נוגדנים משני פלורסנט, אשר ישים עבור איברים עובריים vascularized שבו אנו מסוגלים לבצע את תהליך ההתפתחות של כלי הדם.

Protocol

1. איסוף לימב עובריים בעכבר העור (E13.5 ~ E17.5)

1. להרדים פקוק נוהל שאושר על ידי נשים. על פי פרוטוקול שאושר שלנו חיה, הנקבות מומתים על ידי חשיפה CO ₂ והבטיחה מכן על ידי נקע בצוואר הרחם. הנח את חיה על מגבת נייר סופג שלה ולספוג אותו ביסודיות 70% EtOH / H ₂ O מבקבוק לחיץ.
2. לנתח הרחם שלם ולמקם אותו תבשיל 100 x 15 מ"מ פטרי המכילה תמיסת מלח מאוזן קר כקרח "הנקס (HBSS) כדי לשטוף את הדם.
3. הפרד לנתח את העובר. הסר את amnion דק מאוד מן העובר.
4. (אופציה) לנתח עובר יחיד 35 x 10 צלחת פטרי מ"מ אם העובר כל צריך להיות genotyped. זנב גזור מועברת צינורית PCR 0.2 מ"ל עבור genotyping.
5. לנתק את forelimbs של העובר והעברת forelimbs ידי מלקחיים הטבעת לתוך צלחת 24 היטב המכיל 2 מ"ל של Paraformaldehyde קר כקרח 4% טרי (PFA) ב פוספט הצפת מלוחים (PBS).
6. תקן את forelimbs עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה.
7. למחרת, להסיר את PFA לשטוף שלוש פעמים בתוך 5 דקות של 2 מ"ל PBS עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
8. מעבירים את forelimbs ב 100% מתנול (MeOH) ולאחסן אותן במקפיא -20 ° C אנזים (במקפיא עם בקרת טמפרטורה קריטית וללא פונקציה להפשיר אוטומטית). נוגדנים ראשיים הרשומים לעבוד טבלה מס '1 לאחר הטיפול MeOH 100%.
9. מקלפים את העור מן forelimb באמצעות פינצטה בסדר. העור האיבר, כאשר מיובש, צריך להפריד בקלות בין הגפה. ראשית המקום איבר עם הצד הגחוני (צד כף) פונה כלפי מעלה. ואז בעזרת פינצטה בסדר, לחתוך את העור כפי שמוצג בסרטון. הבא לנתח סביב האיבר כולו, לקלף את העור בעדינות, ללא כל נזק.

2. Whole-Mount מכתים immunohistochemical של Skins לימב

1. רעננותם העור איבר בצינור 5 מ"ל פוליפרופילן מסביב לתחתית ידי דוגרים דרך הסדרה מדורגת של MeOH / PBT דקות (PBS 0.2% + טריטון X-100) 5 (75%, 50%, 25%) עבור כל אחד. שים לב להחלפת פתרונות צריכים להיות זהירים כדי למנוע נזק עורות איבר.
2. לשטוף פעמיים בתוך 5 דקות PBT עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
3. חסום את איבר עם עורות עיזים או 10% נסיוב / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים עז משני או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100 חיץ חסימת עבור נוגדנים חמור משני 2 שעות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בבית טמפרטורת החדר.
4. מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים הראשי (דילול בהתאם המפורטים בטבלאות) במאגר חסימת (או 10% עיזים סרום / PBS 0.2 TX100% או 10% חמור בדם / PBS 0.2% TX100). דגירה עורות איבר עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator ב 4 ° C למשך הלילה. שים לב כי נוגדנים העיקרי מרובים שמקורם מינים שונים (למשל, נוגדן חד שבטי עכברוש + נוגדן ארנבת polyclonal) יכול לשמש בעת ובעונה אחת.
5. למחרת, במקום עורות איבר על 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים לתוך טבעת פוליפרופילן 5 מ"ל מסביב לתחתית צינור עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% TX100 או 2 % דונקי סרום / PBS 0.2% TX100).
6. לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
7. מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור microcentrifuge 2ml, עם 800μl של נוגדנים משני למאגר החסימה (או 10% נסיוב / PBS עיזים 0.2% או 10% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). בדרך כלל אנו משתמשים נוגדנים משני מג'קסון ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 דילולים) או Invitrogen (אלקסה פלואוריד 488, 568 פלואוריד Alexa, Alexa פלואוריד 633, 1:250 דילול). סנן הפתרון נוגדנים משני באמצעות מזרק 0.22μm PVDF מסננים קרום להסיר חלקיקים מצטברים של נוגדנים משני. דגירה עורות איבר בחושך או עטוף בנייר אלומיניום למשך שעה 1 עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב שונות נוגדנים ניאון משני מצומדות נגזר מינים שונים יכול לשמש בעת ובעונה אחת.
8. מניחים את הקליפות על איבר 35 x 10 מ"מ צלחת פטרי והעברת ידי מלקחיים הטבעת לתוך צינור פוליפרופילן 5 מ"ל עגול עם תחתית 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100). לשטוף חמש פעמים במשך 15 דקות בחושך או עטופים ברדיד אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר.
9. (אפשרות counterstaining נגד גרעין) דגירה עורות איבר עם 4ml של למאגר כביסה (או עיזים 2% סרום / PBS 0.2% או 2% TX100 סרום / PBS דונקי 0.2% TX100) עם To-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 דילול) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עבור 10 דקות עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בחדר temperatuמחדש. לאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים במשך 5 דקות עם 4ml של למאגר כביסה (או 2% סרום / PBS עיזים 0.2% או 2% TX100 חמור בדם / PBS 0.2% TX100) בחושך או עטוף בנייר אלומיניום עם ערבוב עדין על מיקסר Nutator בטמפרטורת החדר. שים לב, מכתים חזקה ספציפית עבור גרעינים הוא ציין עבור To-Pro-3 הפליטה ספציפי (עירור HeNe 633 ננומטר).

3. הרכבה Skins לימב על הסט

1. מניחים את הקליפות על איבר 35 x צלחת פטרי 10 מ"מ. הסר dusts, קריסטלים, סיבים בשכבה הפנימית של העור בעזרת פינצטה קנס כאמור stereomicroscope עם תאורה נמוכה, כדי למנוע צילום נרחב הלבנה.
2. מעבירים את הקליפות איבר להחליק מיקרוסקופיים דבק ידי מלקחיים טבעת. מניחים את הקליפות בשכבה הפנימית שוכב מעלה בשקופית (כלומר כלפי coverslip). שטחו את הקליפות בזהירות באמצעות פינצטה בסדר להסיר לשאת על כביסה חיץ ידי Kimwipe.
3. הר אנטי לדעוך התקשורת הרכבה ללא בועות אוויר. אנו משתמשים coverslip 25 "x25". Cure על משטח שטוח בחושך (למשל, באמצעות דגימות רכוב להאריך מגיב זהב ממוקמים לילה בטמפרטורת החדר בחושך לפני הצפייה). עבור אחסון לטווח ארוך, לאטום את coverslip לשקופית ולאחסן ב 4 ° C.

4. Confocal מיקרוסקופית

1. הגדרת לייזרים מתאים fluorophores. אנו משתמשים Leica SP5 TCS מיקרוסקופ confocal עם שלושה מקורות לייזר כולל ארגון 488nm (עבור Alexa פלואוריד 488 ו-GFP), DPSS 561nm (עבור Alexa פלואוריד 568 ו Cy3) ו HeNe 633nm (עבור Alexa פלואוריד 633, Cy5 ו To-Pro-3) .
2. השתמש בכלי סריקה רציפים כדי למנוע או להפחית את crosstalk שבו כל צבעי בדגימות להכפיל או לשלש מוכתם יהיה נרגש באותו זמן. במצב סריקה סדרתית, תמונות תירשם צו רציפים.
3. מידע כללי נוסף על צבעי ניאון ולייזרים עבור עירור ניתן נוסדה בשנת "מיקרוסקופיה confocal עבור ביולוגים" של היבס (2004)

5. נציג תוצאות

Whole-Mount מיקרוסקופיה immnofluorescence תווית משולשת confocal בעור forelimb העכבר E15.5 עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (איור 1A-C, D כחול), סמן neurofilament 2H3 (איור 1A ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (איור 1 א ', ב' אדום) עולה דפוס אופייני הסתעפות של העורקים αSMA ^+, מיושר עם 2H3 ⁺ עצבים היקפיים בעור איבר. בנוסף כלי הדם הסתעפות העור זה איבר מודל vasculature משמש ללמוד דפוסים של כלי הלימפה הסתעפות באמצעות נוגדנים את הסמן אנדותל הלימפה תא LYVE-1 (איור 1D, E אדום) Neuropilin2 (NRP2) (1D איור, F ירוק ).

באיור 1. (AC) העורקים להתיישר עם העצבים ההיקפיים בעור איבר עוברי. Whole-Mount תווית משולשת מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (AC, כחול), סמן neurofilament 2H3 (A, ירוק), תא השריר החלק סמן αSMA (A ו-B, אדום ) מוצג. בשלב E15.5, 2H3 ⁺ העצבים ההיקפיים (חיצים פתוח) לקשר עם העורקים (ראשי חץ) אשר מכוסים על ידי αSMA ⁺ לתאי שריר חלק. (DF) הלימפה בכלי הדם בעור איבר עוברי. התווית Triple-מיקרוסקופיה immnofluorescence confocal עם נוגדנים סמן הפאן אנדותל התא PECAM-1 (D, כחול), סמן תא האנדותל הלימפה LYVE-1 (D ו-E, אדום) Neuropilin2 (NRP2) (D ו-F, ירוק ) מוצג. כלי הלימפה הם דמיינו ידי שני LYVE-1 ו NRP2, ואילו LYVE-1 מתבטא גם על ידי משנה של מקרופאגים (ראשי חץ פתוח). בר סולם: 100μm.

Discussion

מערכת כלי הדם חיונית להתפתחות איבר במהלך embryogenesis כמו גם עבור פונקציות תחזוקה איבר הרבייה אצל מבוגרים, כי הוא מספק מספיק חמצן וחומרים מזינים את האיברים. רשת כלי דם תקין היא מבוססת היטב עם תהליכים מורכבים ורב צעד אנגיוגנזה שבו קיימים רשת נימי הוא מחדש עם מבנים מסועפת מאוד היררכי. למרות עבודות רבות הראו כי מגוון של מולקולות מעורב בתהליכים הללו, זה לא היה ברור עד כמה איברים או רכיבים שלהם לספק את האותות כדי לקדם את התהליך בשלבים של התפתחות כלי הדם, כולל בידול דפוסים האנדותל של כלי הדם הסתעפות. כדי לענות על שאלה זו, המתאימה איברים vascularized שבו אנו מסוגלים לבצע את תהליך ההתפתחות של כלי הדם נדרשים. העור האיבר vasculature מודל עם רווח פונקציה של ואובדן-of-פונקציה מניפולציות גנטיות מאפשר רזולוציה גבוהה ניתוח של התפתחות כלי הדם.

אנו מתארים כאן פרוטוקול מפורט כולל דיסקציה של forelimbs עכבר עובריים, כל הר מכתים immunohistochemical ו מיקרוסקופיה confocal המשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו לנתח את עור איבר אנגיוגנזה lymphangiogenesis. הפרוטוקול מספק תוצאות לשעתקו vasculature שלם עבור מוקדם כמו גם איבר מאוחר העור עובריים היא הדמיה בקלות באמצעות מיקרוסקופיה confocal. זה גם ישים עבור מבוגר האוזן העור vasculature (YM ו ק פרקינס, לא פורסם). כדי להמשיך לחקור את הדמיה של הדינמיקה של צמיחה כלי דם שיפוץ, עם זאת, מודל אחר של בעלי חיים כמו דג הזברה עם כלי דם שכותרתו fluorescently שימושי הדמיה זמן לשגות של vasculature in vivo עם רזולוציה גבוהה.

Whole-Mount מיקרוסקופיה confocal עם תיוג מרובים על ידי סמנים וסקולרית מותר לנו דם תמונה ותאי אנדותל הלימפה, והשכנים שלהם, כולל בתאי השריר pericytes חלקה הקליפות. בנוסף נוגדנים סמן וסקולרית (טבלה 2), נוגדנים עבור גן מוצרים הכתב (β-galactosidase, β-gal ירוק חלבון פלואורסצנטי, GFP, טבלה 2) כי לשחזר את דפוס הביטוי של גנים אנדוגניים עניין שלך יכול לשמש. לדוגמה, השתמשנו העור forelimb מעוברים נושאת כתב lacZ ממוקד ephrinB2 (Wang et al., 1998) או EphB4 מוקד (Gerety et al., 1999), אשר מספק אינדיקטור histochemical של ephrinB2 או EphB4. EphrinB2, ליגנד הטרנסממברני, באה לידי ביטוי על ידי העורקים אך לא ורידים, ואילו לקולטן שלו, EphB4 טירוזין קינאז באה לידי ביטוי מועדף על ידי ורידים (Wang et al., 1998). Whole-Mount ניתוח immunohistochemical בעורות forelimb של E15.5 ephrinB2 ^{lacZ / +} או EphB4 ^{lacZ / +} עוברים הטרוזיגוטיים גילה כי עצבי התחושה היקפי הקשורים מועדף עם כלי העורקים (Mukouyama et al. 2002). עכברים אלו זמינים המעבדה ג'קסון (Efnb2 ^tm1And / J: המניות # 006039, Ephb4 ^tm1And / J: המניות # 006044).

לימוד בשלבים שונים של מערכות אלה כלי הדם מגלה את הדינמיקה הסלולר של אנגיוגנזה כולל הסתעפות כלי הדם, עורקים / ורידים בידול, כלי פיתוח הלימפה והכיסוי חלקה שריר / pericyte בעור איבר המתפתח. עד E13.5, מקלעת נימי פרימיטיבי הוקמה בשנת העור איבר אבל כל קשר בין עצבי התחושה וכלי דם נצפתה. עד E14.5, התרחשה וסקולרית שיפוץ עצבים הקשורים כלי מסועפת שופצה, המבטאים עורקי סמנים תא האנדותל יש αSMA ⁺ לתאי שריר חלק (Mukouyama et al. 2002). מחקרים גנטיים מראים כי עצבי התחושה היקפי לספק תבנית לקביעת דפוסי הסתעפות כלי הדם והבחנה עורקים (Mukouyama et al. 2002). ניתוח של העצבים VEGF-A מוטנטים מותנים גילה כי עצב שמקורם VEGF-A נדרש בידול בתוך עורקי את העור איבר vasculature (Mukouyama et al. 2005). תוצאות המחקר גם הראו כי העצבים VEGF-A מוטנטים מותנים התערוכה ליקוי פחות יישור העצבים כלי שיט, המעידים על מעורבות של גורם נוסף angiogenic (ים). הדבר מצביע על עור איבר vasculature המודל מאפשר לנו לחקור מנגנונים שונים השולטים בידול דפוסים של כלי הדם בעורקים מסתעפת. יתר על כן, מה שולט בידול ורידי ו דפוסים של כלי הלימפה ורידי ו הסתעפות עדיין ייענו.

Materials

Antibodies Pan-endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1 PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2 Arterial endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution Venous endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution Lymphatic endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution Smooth muscle cell/pericyte marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6 NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution Antibodies forGFP reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution Antibodies for LacZ reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution Antibodies for peripheral axon Antibody Species Company Catalogue # Working condition 2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution Antibodies for migrating Schwann cells BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution (P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.