Всего монтажа иммуногистохимического анализа для Эмбриональные сосудистой кожи конечностей: модельная система для исследования сосудистой Ветвление Морфогенез в зародыше

Summary

Введем целом монтажа иммуногистохимии и лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с несколькими маркировки для анализа сложных сосудистых формирование сети в мышиных эмбриональных коже конечностей.

Abstract

Всего монтажа иммуногистохимического анализа для работы с изображениями всего сосудистая сеть имеет решающее значение для понимания клеточных механизмов ветвления морфогенеза. Мы разработали сосудистой коже конечностей модель для изучения развития сосудов, в которых уже существующих примитивных капиллярного сплетения реорганизован в иерархически разветвленной сосудистой сети. Всего монтажа конфокальной микроскопии с несколькими маркировки позволяет надежной визуализации интактных кровеносных сосудов, а также их клеточных компонентов, включая эндотелиальные клетки, перицитов и гладкомышечных клеток, с использованием специфических флуоресцентных маркеров. Достижения в этой сосудистой коже конечностей модель с генетические исследования лучшему пониманию молекулярных механизмов развития сосудов и кучность стрельбы. Сосудистой коже конечностей модель была использована для изучения того, как периферические нервы обеспечивают пространственную шаблон для дифференциации и структурирования артерий. Это видео статье описан простой и надежный протокол пятно нетронутыми сосуды с сосудистыми специфических антител и флуоресцентного вторичными антителами, которая применима для васкуляризированной органов эмбриональных, где мы имеем возможность следить за процессом развития сосудов.

Protocol

1. Сбор мышиных эмбриональных кожи конечностей (E13.5 ~ E17.5)

1. Эвтаназии подключен самок утвержденной процедурой. По нашим утвержденный протокол животных, самки эвтаназии СО ₂ воздействия, а затем обеспечивается шейки дислокации. Положите животное на своих абсорбирующих бумажное полотенце и положите его полностью в 70% EtOH / H ₂ O из бутыли.
2. Рассекать матку нетронутой и поместить его в 100 х 15 мм чашки Петри содержащих сбалансированный солевой ледяной Хэнкса Решение (HBSS), чтобы смыть кровь.
3. Отдельный и анализировать эмбриона. Удалить очень тонкие амнион из эмбриона.
4. (Опция) Рассеките одного эмбриона в 35 х 10 мм блюдо Петри, если каждый эмбрион необходимо генотипирование. Расчлененный хвост передается 0,2 мл ПЦР трубка для генотипирования.
5. Отрежьте передние конечности эмбриона и передачи передние конечности от кольца щипцов в 24-луночный планшет, содержащий 2 мл ледяной свежей 4% Параформальдегид (PFA) в фосфатном буфере физиологический раствор (PBS).
6. Fix передние конечности с нежным перемешивания на Nutator смесителя при температуре 4 ° С в течение ночи.
7. На следующий день, удалить PFA и мыть три раза в течение 5 мин в 2 мл PBS с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
8. Передача передние конечности в 100% метанола (метанол) и хранить их при температуре -20 ° C фермент морозильник (морозильная камера с критической контроля температуры и без функции автоматического размораживания). Первичные антитела, перечисленных в таблице 1 работы после 100% MeOH лечения.
9. Снимите кожу от передних конечностей с использованием тонких пинцетом. Лимб кожи, когда обезвоженной, должен легко отделить от конечностей. Первое место конечности с брюшной стороны (пальмовое сторона) вверх. Затем с помощью тонкой пинцет, разрезать кожу, как показано на видео. Следующая рассекать вокруг всей конечности, шелушение кожи от нежно без каких-либо повреждений.

2. Всего монтажа иммуногистохимического окрашивания конечностей Скины

1. Увлажняет конечностей шкуры в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки путем инкубации через градуированные серии MeOH / PBT (PBS + 0,2% Тритон Х-100) (75%, 50%, 25%) в течение 5 минут каждый. Обратите внимание, что обмен решения должны быть осторожны, чтобы не повредить конечности скинов.
2. Мыть два раза в течение 5 мин в PBT с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
3. Блок конечностей шкуры или с 10% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 блокирующего буфера для коз вторичными антителами, или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100 блокирующего буфера для осла вторичными антителами в течение 2 часов с нежным перемешивания на Nutator смесителя на комнатной температуре.
4. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу в 2 мл щипцы-микроцентрифужных трубка с 800μl первичных антител (соответствующего разбавления, перечисленных в таблицах) в блокирующем буфере (или 10% сыворотки козьего / PBS 0,2 TX100% или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Инкубируйте конечностей шкуры с мягким перемешивания на Nutator смесителя при температуре 4 ° С в течение ночи. Обратите внимание, что несколько первичных антител, полученных из различных видов (например, крысы моноклональное антитело + кролик поликлональных антител) могут использоваться одновременно.
5. На следующий день, место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу щипцов в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS 0,2% или 2 TX100 Осел% сыворотки / PBS +0,2% TX100).
6. Вымойте пять раз в течение 15 мин с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
7. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу в 2 мл щипцы-микроцентрифужных трубка с 800μl вторичного антитела в блокирующем буфере (или 10% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 10% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Обычно мы используем вторичные антитела от Джексона ImmunoResearch (Cy3, Cy5, 1:300 разведения) или Invitrogen (Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 633, 1:250 разведение). Фильтры вторичных решение антител при 0.22μm PVDF мембранных фильтров шприц для удаления агрегированных частиц вторичных антител. Инкубируйте конечностей шкуры в темноте или обернуты алюминиевой фольгой в течение 1 часа с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре. Обратите внимание, что различные флуоресцентные сопряженных вторичными антителами, полученных из различных видов могут быть использованы одновременно.
8. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм чашки Петри и передачи по кольцу щипцов в 5 мл полипропилен с круглым дном трубки с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100). Вымойте пять раз в течение 15 мин в темноте или обернуты алюминиевой фольгой с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре.
9. (Вариант для counterstaining против ядра) Инкубируйте конечностей шкуры с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100) с К-Pro-3 (Invitrogen T3605 , 1:3000 разбавления) в темное время суток или завернутые с алюминиевой фольгой в течение 10 мин с нежным перемешивания на Nutator смесителя при комнатной temperatuповторно. Затем вымыть три раза в течение 5 мин с 4 мл промывочного буфера (или 2% сыворотки козьего / PBS +0,2% TX100 или 2% Donkey сыворотки / PBS +0,2% TX100) в темное время суток или в оболочку из алюминиевой фольги с мягким перемешивания на Nutator смесителя при комнатной температуре. Обратите внимание, что сильный и специфического окрашивания для ядер наблюдается To-PRO-3 в удельных выбросов (гелий-неоновый 633 нм возбуждение).

3. Монтаж Limb Скины на слайде

1. Место конечностей шкуры на 35 х 10 мм блюдо Петри. Удаление пыли, кристаллы, волокна от внутреннего слоя шкуры с использованием тонких пинцетом под стереомикроскопа с низкой освещенности, чтобы избежать обширных фото отбеливание.
2. Передача конечностей шкуры клея микроскопических слайд кольца щипцов. Место кожи с внутренним слоем лежал вверх на слайде (т.е. к покровным). Свести шкуры тщательно с использованием тонких пинцет и удалите переноса моющий буфер Kimwipe.
3. Горы в анти-Fade монтажа СМИ без пузырьков воздуха. Мы используем 25 "x25" покровным. Лечение на плоской поверхности в темное время суток (например, образцы смонтированы командами Продли Золотой реагента размещены на ночь в темноте при комнатной температуре перед просмотром). Для длительного хранения, печать покровное для слайдов и хранить при 4 ° C.

4. Конфокальной микроскопии

1. Настройка соответствующих лазеров для флуорофоров. Мы используем Leica TCS SP5 конфокальной микроскопии с тремя лазерных источников, включая Аргон 488nm (для Alexa Fluor 488 и GFP), DPSS 561nm (для Alexa Fluor 568 и Cy3) и гелий-неоновый 633 нм (для Alexa Fluor 633, Cy5 и To-Pro-3) .
2. Использование последовательного инструмент сканирования, чтобы избежать или уменьшить перекрестные помехи, в котором все красители в двойной или тройной окрашенных образцов будут в восторге, в то же время. В последовательном режиме сканирования изображения будут записаны в последовательном порядке.
3. Более общие сведения о флуоресцентных красителей и лазеров для возбуждения может быть создан в "конфокальной микроскопии для биологов" по Хиббса (2004)

5. Представитель Результаты

Всего монтажа тройной этикетки конфокальной микроскопии в immnofluorescence мыши лапы кожу на E15.5 с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (рис. 1А-C, D синий), нейрофиламентов маркер 2H3 (рис. 1А зеленый), и гладкие мышечные клетки маркером αSMA (рис. 1а, б красный) показало, характерные ветвящиеся структуры αSMA ⁺ артерий, в соответствие с 2H3 ⁺ периферических нервов конечностей в кожу. В дополнение к ветвления кровеносных сосудов, это сосудистой коже конечностей модель используется для изучения паттернов лимфатический сосуд ветвления с использованием антител к эндотелиальной лимфатической маркер ячейки LYVE-1 (Рис. 1D, E красный) и Neuropilin2 (NRP2) (рис. 1D, F зеленый ).

Рисунок 1. (AC) Артерии согласования с периферических нервов в эмбриональной коже конечностей. Всего монтажа тройной этикетки конфокальной микроскопии immnofluorescence с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (AC, синий), нейрофиламентов маркер 2H3 (зеленый) и гладкие мышечные клетки маркером αSMA (А и В, красный ) показано. На E15.5, 2H3 ⁺ периферических нервов (открытые стрелки) ассоциируется с артериями (наконечники стрел), на которые распространяются αSMA ⁺ гладкомышечных клеток. (DF) лимфатической сосудистой в эмбриональной коже конечностей. Triple-этикетку конфокальной микроскопии immnofluorescence с антителами к пан-эндотелиальных клеток маркера PECAM-1 (D, синий), лимфатических эндотелиальных маркер ячейки LYVE-1 (D и Е, красный) и Neuropilin2 (NRP2) (D и F, зеленый ) показано. Лимфатические сосуды визуализируются как LYVE-1 и NRP2, в то время LYVE-1 выражается также подмножество макрофагов (открытый наконечники стрел). Шкала бар: 100 мкм.

Discussion

Сосудистой системы имеет решающее значение для развития органов во время эмбриогенеза, а также для обслуживания органов и репродуктивных функций у взрослых, потому что он поставляет достаточное количество кислорода и питательных веществ к органам. Правильное сосудистой сети хорошо разработана со сложной и многоступенчатой ​​процессов ангиогенеза, в котором уже существующих капиллярной сети реорганизован с весьма разветвленной и иерархические структуры. Несмотря на многочисленные работы, как было показано, что разнообразие молекул, вовлеченных в эти процессы, это не было ясно, как органы или их компоненты обеспечивают сигналы для содействия поэтапный процесс сосудистого эндотелия, включая развитие дифференциации и структурирования сосудистых ветвления. Для решения этого вопроса, соответствующие органы васкуляризированной, где мы имеем возможность следить за процессом развития сосудов не требуется. Сосудистой коже конечностей модель с усилением-функции и потерей функции генетических манипуляций позволяет с высоким разрешением анализ развития сосудов.

Мы описываем здесь подробный протокол вскрытия в том числе эмбриональных передние конечности мыши, весь монтаж иммуногистохимического окрашивания и конфокальной микроскопии, который обычно используется в нашей лаборатории для анализа конечностей ангиогенеза кожи и lymphangiogenesis. Протокол обеспечивает воспроизводимость результатов и неповрежденной сосудистой для раннего и позднего эмбрионального кожи конечностей легко изображено конфокальной микроскопии. Он также применим и для взрослого уха кожи сосудистую (Ю. М. и К. Перкинс, не опубликовано). Для дальнейшего изучения изображений динамика крови роста судна и ремонт, однако, и другие модели животное, как данио с флуоресцентно меченных кровеносных сосудов полезна для покадровой визуализации сосудистой в естественных условиях с высоким разрешением.

Всего монтажа конфокальной микроскопии с несколькими маркировки сосудистыми маркеров позволило крови и лимфатической изображение эндотелиальных клеток, и их соседей в том числе гладкомышечных клеток и перицитов в шкуры. В дополнение к сосудистой антител маркеров (табл. 2), антитела к ген-репортер продукции (β-галактозидазы, β-гал и зеленого флуоресцентного белка, GFP, таблица 2), что повторять экспрессии эндогенных генов Ваш интерес может быть использован. Например, мы использовали лапы кожу от эмбрионов проведения LacZ репортер, ориентированные на ephrinB2 (Wang и соавт., 1998) или EphB4 локус (Gerety и соавт., 1999), которая обеспечивает гистохимических показателей ephrinB2 или EphB4. EphrinB2, трансмембранный лиганд, выражается артерий, но не жил, а его рецепторов, тирозин киназ EphB4 является преимущественно выраженных вен (Wang и соавт., 1998). Всего монтажа иммуногистохимического анализа в лапы шкуры E15.5 ephrinB2 ^{LacZ / +} или EphB4 ^{LacZ / +} гетерозиготных эмбрионов показало, что периферические чувствительные нервы связаны преимущественно с артериальных сосудов (Mukouyama и соавт. 2002). Эти мыши доступны в лаборатории Джексона (Efnb2 ^tm1And / J: Лот № 006039, Ephb4 ^tm1And / J: Лот № 006044).

Изучение различных стадиях эти сосудистой систем показывает, клеточной динамики ангиогенеза включая сосудистые разветвления, артериальной / венозной дифференциации, развития лимфатических сосудов и гладкой мускулатуры / перицитов освещение в развивающихся конечностей кожи. По E13.5, примитивные капиллярного сплетения была создана в конечности кожи, но никакой связи между чувствительных нервов и кровеносных сосудов не наблюдается. По E14.5, сосудистого ремоделирования произошло и нервов связанных с отремонтирован разветвленной сосуды, которые выражают артериальных эндотелиальных клеток и маркеры имеют αSMA ⁺ гладкомышечных клеток (Mukouyama и соавт. 2002). Генетические исследования показывают, что периферические чувствительные нервы служить образцом для определения кровеносных сосудов ветвящиеся узоры и артериальной дифференциации (Mukouyama и соавт. 2002). Анализ нерв-VEGF-условное мутантов показал, что нервные происхождения VEGF-A требуется для артериальной дифференциации в коже конечностей сосудистую (Mukouyama и соавт. 2005). Наши результаты также показали, что нервные VEGF-условное мутантов выставки за вычетом обесценения нервных сосудов выравнивания, что свидетельствует привлечение дополнительного ангиогенного фактора (ов). Это говорит о том, что сосудистая сеть кожи конечностей модель позволяет изучать различные механизмы, которые контролируют артериальное дифференциации и структурирования сосудистых ветвления. Кроме того, что контроль дифференциации венозной и структурирование венозный и лимфатический сосуд ветвления по-прежнему остается без ответа.

Materials

Antibodies Pan-endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition PECAM-1 Armenian hamster (M) Chemicon MAB1398Z 1:100 dilution#1 PECAM-1 Rat (M) BD 553369 1:300 dilution VEGFR2 Rat (M) eBioscience 14-5821-82 1:200 dilution CD34 Rat (M) eBioscience 13-0341 1:300 dilution Collagen IV Rabbit (P) AbD Serotec 2150-1470 1:300 dilution#2 Arterial endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition Neuropilin1 Rabbit (P) The Alex Kolodkin’s lab#3 1:3000 dilution Unc5H2 Goat (P) R&D AF1006 1:200 dilution Venous endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition EphB4 Goat (P) R&D AF446 1:100 dilution Lymphatic endothelial cell marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition LYVE-1#4 Rabbit (P) Abcam ab14917 1:200 dilution LYVE-1#4 Rat (M) MBL D225-3 1:200 dilution Prox-1 Rabbit (P) Chemicon AB5475 1:1000 dilution Prox-1 Goat (P) R&D AF2727 1:50 dilution Neuropilin2 Rabbit (P) Cell Signaling 3366 1;100 dilution Podoplanin Syrian hamster (M) Hybridoma Bank 8.1.1 1:200 dilution Smooth muscle cell/pericyte marker Antibody Species Company Catalogue # Working condition αSMA-Cy3 Mouse (M)#5 Sigma c-6198 1:500 dilution#6 NG2 Rabbit (P) Chemicon AB5320 1:200 dilution SM22α Rabbit (P) Abcam ab14106 1:200 dilution Antibodies forGFP reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition GFP Rabbit (P) Invitrogen A11122 1:300 dilution GFP Rat (M) Nacalai tesque 04404-84 1:1000 dilution GFP Chick (P) Chemicon P42212 1:300 dilution Antibodies for LacZ reporter Antibody Species Company Catalogue # Working condition β-gal Rabbit (P) MP Biomedical 55976 1:5000 dilution β-gal Goat (P) AbD Serotec 4600-1409 1:500 dilution β-gal Chick (P) Abcam ab9361 1:200 dilution Antibodies for peripheral axon Antibody Species Company Catalogue # Working condition 2H3 Mouse (M)#7 Hybridoma Bank 2H3 1:200 dilution Tuj1 Mouse (M)#8 Covance MMS-435P 1:500 dilution Peripherin Rabbit (P) Chemicon AB1530 1:1000 dilution Antibodies for migrating Schwann cells BFABP Rabbit (P) The Thomas Müller’s lab#9 1:3000 dilution (P): polyclonal antibody, (M): monoclonal antibody #1: Goat anti-Armenian hamster-Cy3 (Jackson ImmunoResearch 127-165-160) antibody should be used as a secondary antibody. #2: The Collagen IV antibody can be used to detect blood vessels after in situ hybridization. #3: The Neuropilin1 antibody is kindly provided by the Alex Kolodkin’s lab in the Johns Hopkins University. Sheep anti-human Neuropilin1 antibody is available in R&D (AF3870), although we have not tested it yet. #4: The LYVE-1 antibodies also detect a subset of macrophages in the embryonic skin. #5: The anti-αSMA antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody. #6: The Cy3-conjugated αSMA antibody is incubated for 1 hour at room temperature together with secondary antibodies for other primary antibodies. #7: 2H3 antibody is mouse IgG1 monoclonal antibody against neurofilament. #8: Tuj1 antibody is mouse IgG2a monoclonal antibody against Neuron-specific class III beta-tubulin. #9: The BFABP (brain-specific fatty acid binding protein) antibody is kindly provided by the Thomas Müller’s lab in Max-Delbrück-Center for Molecular Medicine.