Summary
De bijbehorende chromosoom val (ACT) assay is een nieuwe onpartijdige methode voor het identificeren van lange-afstands-DNA interacties. De karakterisering van de lange reeks DNA-interacties zal ons toelaten om de relatie van de nucleaire architectuur vast te stellen om genexpressie in zowel de normale fysiologie en in zieke staten.
Abstract
Genetische informatie gecodeerd door DNA is georganiseerd in een complexe en sterk gereguleerd chromatine structuur. Elk chromosoom is gevestigd in een bepaald gebied, die kunnen veranderen afhankelijk van stadium van ontwikkeling of celcyclus. Genexpressie kan optreden in de gespecialiseerde transcriptionele fabrieken waar chromatine segmenten kunnen lus uit verschillende chromosoom gebieden, wat leidt tot co-lokalisatie van DNA segmenten die kunnen bestaan op verschillende chromosomen of ver van elkaar op hetzelfde chromosoom. De Associated Chromosome Trap (ACT) assay is een effectieve methodiek om deze lange afstand DNA verenigingen in een onpartijdige wijze te identificeren door uitbreiding en wijziging van het chromosoom bouw vast te leggen techniek. De ACT-test maakt het mogelijk voor ons om te onderzoeken mechanismen van transcriptionele regulatie in trans, en kunnen helpen verklaren de relatie van nucleaire architectuur tot gen expressie in normale fysiologie en tijdens de ziekte staten.
Protocol
1. Formaldehyde fixatie van lange-afstands chromatine interacties
- Cultuur menselijke cellijn HL-60 in RPMI1640 medium met 15% FBS en 1 x penicilline / streptomycine tot 80-90% confluentie in een incubator geleverd met 5% CO 2 bij 37 ° C.
- Het verzamelen van de cellen in een 50 ml buis Nunc, centrifugeer bij 1200 rpm gedurende 15 minuten, en verwijder het medium door aspiratie
- Voeg 5 ml kweekmedium aan de cel pellets resuspenderen, en de cellen met behulp van een hemocytometer tellen. Duurt ongeveer 1 x 10 7 cellen tot een volume van 40 ml met RPMI1640 / 10% FBS, voeg vervolgens 1,7 ml 37% formaldehyde om de verdunde chromatine op te lossen.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten onder zacht schudden, en dan blussen met 2,4 ml 2M glycine. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 1200 rpm bij 4 ° C, en verwijder het supernatant. Zodra Was de pellet met 40 ml ijskoude PBS, dan spin down van de pellet en verwijder de PBS.
2. Cellysis om kernen te isoleren
- Resuspendeer cellen in 40 ml ijskoud lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) met vers toegevoegde proteaseremmers (1:500 verdunning) en 0,1 mM PMSF. Incubeer in een koude ruimte met de rotatie van 90 minuten, centrifugeer bij 2500 rpm gedurende 15 minuten, en verwijder het supernatant.
3. Restrictie-enzym digestie met Bgl II
- Resuspendeer de kernen in 0,5 ml 1 x NEB buffer 3, en voeg 15 μlof 10% SDS. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur met schudden, en voeg 45 ul van 20% Triton X-100 aan de SDS sekwestreren. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur met schudden.
- Gebruik een hoeveelheid van 1 x 10 6 kernen (ongeveer 15 ug, een tiende van de oorspronkelijke cellen) voor de restrictie-enzym spijsvertering. Neem 55 ul van kernen oplossing van stap 3.1 en vul aan tot 500 pi met 433 ul van 1 x NEB buffer 3 en 12 pl van BGL II (50U/ul). Incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht.
4. Ligatie van interactie DNA-segmenten
- Inactiveren het restrictie-enzym door het toevoegen van 95 pi van 10% SDS, en denatureren door verhitting bij 65 ° C gedurende 20 minuten in een waterbad.
- Voeg 7 ml 1 x ligatie buffer (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) en 360 ul van 20% Triton X-100 en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur .
- Verlaag de temperatuur tot 16 ° C en voeg 50 ul van 400 U / ul T4 DNA-ligase. Incubeer het monster bij 16 ° C gedurende 4 uur en daarna bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
5. DNA-zuivering
- Voeg 300 ug van proteinase K, en incubeer bij 65 ° C gedurende de nacht.
- Voeg 5 ug van RNase A en incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten
- Zuiver DNA door fenol / chloroform extractie, en neerslag DNA in isopropanol. Los DNA in 150 pi steriel gedistilleerd water.
6. Spijsvertering met MSP I en ligatie met oligonucleotide linkers
- Incubeer 2μg gezuiverd DNA met vijf eenheden van MSP ik bij 37 ° C gedurende 4-6 uur. Inactiveren MSP ik bij 65 ° C gedurende 10 minuten, dan neerslag het DNA in ethanol met 1 pl van 5 mg / ml glycogeen. Los van de DNA-pellet in 50 ul steriel gedistilleerd water.
- Meng 50 ul van MSP I-DNA behandeld met 2 pi van een 20 pM linker oligonucleotide L (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 ui van een 20 pM oligonucleotide S (5'-cggtgaatc-3'), 1 ui steriel gedestilleerd water en 6 pi van 10 x T4 DNA-ligase buffer. Bedek het mengsel met vloeibare was.
- Denatureren oligonucleotiden bij 50 ° C gedurende 1 minuut en laat geleidelijk afkoelen tot 10 ° C in een 0,5 ° C / minuut gradiënt in een thermische cycler.
- Voeg 1 ui van 400 U / ul T4 DNA-ligase en incubeer bij 15 ° C gedurende de nacht. Zuiveren de linker-geligeerde DNA met behulp van een QIAquick PCR zuivering kit, en elueren in 50 ul van steriel gedistilleerd water.
7. PCR-amplificatie en sequentie-analyse
- Kies een primer voor de specifieke regio van DNA die u wenst te onderzoeken op lange afstand interacties (dat wil zeggen het 'lokaas'). In dit voorbeeld gebruiken we ABL-1.
- Neem een ui van het gezuiverde DNA naar de eerste ronde PCR met behulp van een ui van 20 uM ABL -1 specifieke primer # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 ui van 20 uM linker specifieke primer # 2.963 (uitvoeren van 5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl van 3 x Klen Taq DNA-polymerase I cocktail en 3 pi steriel gedistilleerd water. Twee pi van 32 P-dCTP wordt toegevoegd aan 100 ul van 3 x Klen Taq DNA-polymerase I cocktail voor PCR-amplificatie. De thermische cyclus voor een warme start PCR is 72 ° C gedurende 2 min, 95 ° Cfor 2 minuten, 18 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden, 65 ° C gedurende 40 seconden en 72 ° C gedurende 1 minuut, de laatste verlenging wordt uitgevoerd bij 72 ° Cgedurende 5 minuten.
- Zuiveren de eerste ronde PCR-producten met behulp van een QIAquick PCR zuivering kit, en elueer DNA in 30 pi van steriel gedistilleerd water.
- Neem een pi van 100 x verdund eerste PCR product dat een tweede ronde van PCR met geneste primers uit te voeren door het toevoegen van een pi van 20 uM ABL-1-specifieke primer # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (figuur 1a), 1 ui van 20 uM van linker specifieke primer # 2.961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 pl van 3 x Klen Taq DNA-polymerase I cocktail en 3 pi steriel gedistilleerd water. De thermische fietsen schema is 25 cycli van 95 ° C gedurende 20 seconden, 67 ° C gedurende 40 seconden en 72 ° C gedurende 1 minuut, gevolgd door een extensie bij 72 ° C gedurende 5 minuten.
- Visualiseer de PCR-producten door het uitvoeren van een 5% ureum-PAGE-gel en het scannen van de blootgestelde scherm in een PhosphoImager (Figuur 1b). Elke PCR-band kan worden gerecycled uit de gel door het oplossen van de gel strips in een Eppendorf buisje met 60 pi van steriel gedestilleerd water, en incuberen bij 95 ° C gedurende 5 minuten. Centrifugeer kort bij 10.000 rpm gedurende 10 seconden om alle monsters te verzamelen. Verwijder een ui te gebruiken als de DNA-template aan PCR met de primerpaar 2961/4626 met dezelfde voorwaarden als hierboven beschreven uit te voeren. Sequentie-analyse kan worden uitgevoerd na zuivering met behulp van een QIAquick PCR Purification kit.
- DNA-sequenties worden geanalyseerd met behulp van een online tool om hun chromosomale locatie op de website te bepalen: http://genome.ucsc.edu (Figuur 1c). Klik op 'BLAT' om een nieuw venster die het mogelijk maakt om te plakken een DNA-sequentie te voeren, een nieuw venster verschijnt na het klikken op 'submit', en toont de 'BLAT Search Results'. Klik op 'browser' van de hit met 100% identiteit aan een volgende venster in te voeren om de locatie van de DNA-sequentie te tonen.
8. Representatieve resultaten
1. ACT test met behulp van ABL-1 regio als lokaas om de lange afstand DNA interacties vast te stellen
Zoals weergegeven in Figuur 1a, twee Bgl II sites en een BamH I site zijn gekozen voor de ACT-test. In de tweede ronde van PCR, primer set 4626/2961 werd gebruikt voor het ABL-M1 te versterken, werd 4630/2961 gebruikt voor ABL-M2, en 4636/2961 werd gebruikt voor ABL-M3. Een typisch gel patroon toont een tot enkele bands (Figuur 1b). Elk fragment van een ACT-test bestaat uit twee gecombineerde DNA-segmenten: een segment is afgeleid van het aas DNA-regio, terwijl het tweede segment komt van de geassocieerde partner, die aan het aas regio segment samen met de eerste restrictie-enzym herkenningssequentie. De tweede enzym herkenningssequentie zal verschijnen aan het einde van de geassocieerde partner volgorde (figuur 1c). De gekloonde ABL-M1 fragment bevat DNA van de regio van ABL1 ligt op chromosoom 9q32.4 van +133,592,306-133,592,399, en de bijbehorende partner is gelegen op chromosoom 3p13 van +71,869,882-71,870,107. De identiteit van de geassocieerde partners worden ontdekt door middel van stralen hun sequenties met behulp van de UCSC genoom browser (GRCh7/hg19 uitgebracht in februari 2009). PROK2 werd geïdentificeerd als de bijbehorende partner bij de chr3p13 locus.
Ook was het ABL-M2 geassocieerd partner gelokaliseerd chr5q21.1, terwijl kloon ABL-M3 werd geïdentificeerd als een intra-chromosomale vereniging de buurt van de ABL-1 locus.
2. Het bepalen minder vaak voor lange afstand interacties met behulp van ACT-test
Andere testen op basis van 3C hebben gemeld veel meer interagerende partners dan dat we hebben laten zien in figuur 1 en op de Igf2 / H19 locus 12. De methodologie die wij hebben geschetst selecteert de meest voorkomende lange afstand interacties. Echter, door toename van het aantal PCR-cycli, is het mogelijk om bijkomende, minder vaak associaties te identificeren en (figuur 2).
3. Verschillen in long range interacties in kankercellen in vergelijking met normale weefsels.
De ACT-test kan ook worden gebruikt om verschillen in de nucleaire architectuur en de lange afstand interacties tussen normale cellen en kankercellen (figuur 3) te identificeren. Deze verschillen kunnen reflecteren nucleaire architectuur veranderingen die optreden tijdens de cel transformatie, en dus deze test kan uiteindelijk worden toegepast voor diagnostische doeleinden. De vergelijkbare gel patronen die zich voordoen in zowel de normale en kanker weefsels aangegeven dat de ACT-test is betrouwbaar en herhaalbaar. Terwijl de ACT-test kan identificeren lange reeks DNA-partners, verdere analyses, zoals fish and chips testen, zijn verplicht om de aanwezigheid van de geconstateerde verbanden tussen ver loci te controleren. Genetische, fysiologische en biochemische studies kan dan worden uitgevoerd om de biologische gevolgen van deze lange reeks DNA-verenigingen toe te lichten.
Figuur 1 ACT test met behulp van ABL-1 regio als lokaas DNA in HL-60 cellen. a. DNA-structure in de ABL-1 regio. De eerste restrictie-enzym gebruikt in ACT-test was Bgl II. De primers voor de tweede ronde van PCR zijn ook gelabeld door middel van pijlen en bijbehorende primer nummers. b. Gel patroon van de ACT-test in 5% ureum-PAGE. Primerpaar 4626/2961 werd gebruikt voor het versterken kloon ABL-M1 in de geneste PCR, werd gebruikt voor 4630/2961 kloon ABL-M2, en 4636/2961 werd gebruikt voor kloon ABL-M3. c. DNA-sequentie van kloon ABL-M1. DNA-fragment van ABL-1 aas DNA is gelabeld in het rood, en de bijbehorende DNA-partner is geëtiketteerd in cyaan. Bgl II site (AGACTC) werd gelabeld in het groen, en MSP ik site (CCGG) is geëtiketteerd in paars.
Figuur 2 PCR-cycli beïnvloeden ACT test resultaten. Met de imprint controle regio (ICR) van de Igf2/H19 locus als lokaas DNA in de muis fibroblast cellen, werden verschillende fietsen programma's die in de eerste en tweede ronde van PCR in het ACT-test. 18-20 cycli in de eerste ronde van PCR niet versterken genoeg signaal zichtbaar worden gemaakt. Twintig vijf cycli in de tweede PCR-resultaten in duidelijke banden, terwijl het verhogen van het aantal cycli voor de tweede ronde van PCR veroorzaakte een uitstrijkje patroon in aanvulling op meer bands.
Figuur 3 Detectie van verschillen in de nucleaire architectuur tussen normale dikke darm weefsel en dikke darm kanker weefsel in ACT-test. A. DNA-structuur van de ICR regio op IGF2/H19 locus en IGF2-gen. DPN II sites voor ACT-test zijn gelabeld. Primers worden gebruikt in de tweede ronde PCR worden gelabeld door de pijlen en nummers in verschillende kleuren die overeenkomen met elke baan in het paneel onder b van de figuur. b. Gel patroon van de ACT-test in 5% ureum-PAGE. Normale dikke darm weefsel MAD03-1423-en darmkanker weefsel MAD04-149 werd verkregen van Coöperatieve Human Tissue Network (CHTN) West Division. Na elke dikke darm weefsel werd gehomogeniseerd, werd ACT test uitgevoerd volgens de procedures beschreven. Baan 1 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') gemerkt in het roze in het paneel een, baan 2 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961 en # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') gemerkt in het oranje in het paneel een, baan 3 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961 en # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') gemerkt in het blauw in het paneel een; baan 4 staat voor de PCR-resultaten met behulp van primerpaar # 2961 en # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') gemerkt in het groen in paneel A. Unieke bands die alleen verschijnen in de normale dikke darm weefsel worden gelabeld door gele pijlen, en die bands die alleen verscheen in darmkanker weefsel zijn geëtiketteerd in rode pijlen. ICR, imprinting controle regio, DMR, verschillende gemethyleerde regio.
Discussion
Dekker et al.. Ontwikkelde het chromosoom exterieur capture (3C) benadering van de frequentie van de interactie tussen twee genomische loci een te detecteren, en 3C is uitgebreid gebruikt voor het intra-chromosomale en inter-chromosomale associaties te onderzoeken tussen twee bekende DNA-regio's in zoogdiercellen 2 -9. Hoewel de nieuw ontwikkelde Hi-C methodiek kan worden toegepast voor de studie van het genoom-brede associatie DNA, ACT-test is nog steeds een effectieve techniek voor de studie van de locus-specifieke DNA-interactie 10-11. We hebben deze aanpak gewijzigd naar onbekende DNA-regio's die zijn gekoppeld aan een bekende DNA-regio in gekweekte muizen en menselijke cellen (figuur 1) te identificeren. We noemde deze methode de bijbehorende chromosoom val (ACT) test, want het heeft ons een betrouwbare en reproduceerbare methode om nieuwe onbekende DNA-partners die associëren met een bekende doel-DNA regio 12 te identificeren. Een succesvolle test met 3C nodige controles wordt uitgevoerd vóór het uitvoeren van de nieuwe aspecten van het ACT-test 13. Om tofind zo veel geassocieerd DNA regio's mogelijk te maken, is het noodzakelijk om verschillende combinaties van eerste en tweede restrictie-enzymen te gebruiken. Het is vooral belangrijk om restrictie-enzymen die ongevoelig zijn voor CpG methylering om de eerste 3C ligatie stap uit te voeren. De eiwitbinding en DNA-methylering kan ook van invloed zijn restrictie-enzym vertering efficiency en kan leiden tot het falen van ligatie van de bijbehorende DNA-regio's voor bepaalde restrictie-enzym ontsluitingen. Het optreden van intra-of inter-chromosomale ligatie is afhankelijk van eiwit-DNA cross-linking en passende fysieke kaarten van zowel van de bijbehorende DNA-regio's. Zo, enkele voorlopige experimenten zijn essentieel voor een effectieve praktisch formaldehyde concentratie en de duur van de behandeling te vestigen in de ACT-test. Een reeks van de uiteindelijke concentratie van formaldehyde (from1.5% tot 2%) werden gebruikt in verschillende labo's tijdens de 3C gedeelte van de test 7,9. Als alternatief kan de oligonucleotiden gebruikt als linkers worden ontworpen om het cohesieve uiteinde gesneden door de tweede restrictie-enzym wedstrijd. Hoewel wij vonden dat 18 tot 20 cycli in de eerste ronde van PCR en 20-25 cycli in de tweede ronde van PCR kon duidelijk bands te bieden, is het noodzakelijk om vast te stellen de beste PCR-condities voor elk experiment (figuur 2). Intra-molecuul gloeien tussen 5'-uiteinde en het 3'-uiteinde complementaire adapter sequentie van een DNA-streng kan optreden in PCR, het remt adapter-specifieke primer annealing met het DNA-molecuul, en resulteerde in veel lagere amplificatie-efficiëntie in de eerste paar cycli. Nadat het doel-DNA werd geamplificeerd voor cycli, kan het bedrag veel groter zijn dan deze niet-specifieke reacties, en kan de concurrentie van primer annealing om het doel DNA-moleculen te vergemakkelijken. Dat is ook de reden waarom wij achtergrond versterking te zien, en waarom de eerste ronde PCR-product moet worden verdund op de achtergrond amplification.It daling is het van belang om overtollig primers te verwijderen uit het PCR-reactie om de achtergrond daling in de tweede ronde van PCR. Zoals in alle PCR-gebaseerde experimenten, is het essentieel om het ontwerp primers die zich niet bevindt in herhaling reeks regio's, die de meerderheid van mens en muis DNA vormen. Hoewel de nieuw ontwikkelde Hi-C methodiek kan worden toegepast voor de studie van het genoom-brede associatie DNA, ACT-test is nog steeds een effectieve techniek voor de studie van de locus-specifieke DNA-interactie.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We danken Adelle Murell en Wolf Reik hartelijk voor het delen van hun 3C protocol. Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Defensie en de Research Service van het Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | |
| acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | |
| ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-039 | |
| SDS | Invitrogen | 15525-017 | |
| urea | Invitrogen | 15505-035 | |
| BamH I | New England Biolabs | R0136T | |
| Bgl II | New England Biolabs | R0144M | |
| Dpn II | New England Biolabs | R0543T | |
| Msp I | New England Biolabs | R0106S | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
| proteinase K | New England Biolabs | P8102S | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | |
| proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Nonidet P-40 | Roche Group | 11754599001 | |
| KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | |
| dCTP alpha P32 | PerkinElmer, Inc. | BLU513H250UC | |
| PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | |
| Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | |
| OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |
References
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
- Apostolou, E., Thanos, D. Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression. Cell. 134, 85-96 (2008).
- Duan, Z. A three-dimensional model of the yeast genome. Nature. 465, 363-367 (2010).
- Lomvardas, S. Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell. 126, 403-413 (2006).
- Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet. 36, 889-893 (2004).
- Schoenfelder, S. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat Genet. 42, 53-61 (2010).
- Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature. 435, 637-645 (2005).
- Vakoc, C. R. Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. Mol Cell. 17, 453-462 (2005).
- Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation. Science. 311, 1149-1152 (2006).
- Lieberman-Aiden, E. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Berkum, N. L. van Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. J Vis Exp. , (2010).
- Ling, J. Q. CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1. Science. 312, 269-272 (2006).
- Dekker, J. The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods. 3, 17-21 (2006).
