Summary
La trampa de cromosoma asociados (ACT) de ensayo es un nuevo método imparcial para la identificación de largo alcance interacciones ADN. La caracterización de las interacciones de largo alcance de ADN nos permitirá determinar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión génica en la fisiología normal y en estados de enfermedad.
Abstract
La información genética codificada por el ADN está organizado en una estructura de la cromatina complejo y altamente regulado. Cada cromosoma ocupa un territorio específico, que puede variar de acuerdo a la etapa de desarrollo o del ciclo celular. La expresión de genes puede ocurrir en las fábricas especializadas en los segmentos de la transcripción de la cromatina puede salida en lazo de los territorios de varios cromosomas, dando lugar a la co-localización de segmentos de ADN que pueden existir en diferentes cromosomas o muy separados en el mismo cromosoma. La trampa de cromosomas asociados (ACT) de ensayo proporciona una metodología eficaz para identificar el ADN de estas asociaciones a largo plazo de una manera imparcial mediante la ampliación y modificación de la conformación técnica de captura de los cromosomas. La prueba ACT hace posible para nosotros para investigar los mecanismos de regulación transcripcional en trans, y puede ayudar a explicar la relación de la arquitectura nuclear de la expresión de genes en la fisiología normal y durante estados de enfermedad.
Protocol
1. El formaldehído fijación de las interacciones de la cromatina de largo alcance
- La línea de cultivo de células humanas HL-60 en medio RPMI1640 con FBS al 15% y 1 x penicilina / estreptomicina al 80-90% de confluencia en una incubadora suministra con 5% de CO 2 a 37 ° C.
- Recoger las células en un tubo de 50 ml Nunc, se centrifuga a 1.200 rpm durante 15 minutos, y luego eliminar el medio por aspiración
- Añadir 5 ml de medio de cultivo para volver a suspender los sedimentos celulares, y contar las células utilizando un hemocitómetro. Tome aproximadamente 1 x 10 7 células en un volumen de 40 ml con FBS RPMI1640 / 10%, a continuación, añadir 1,7 ml de formaldehído al 37% para arreglar la cromatina diluido.
- Incube a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave, y luego apagar con 2,4 ml de glicina 2M. Centrifugar durante 15 minutos a 1200 rpm a 4 ° C, y eliminar el sobrenadante. Lavar el sedimento una vez con 40 ml de PBS frío hielo, y luego girar hacia abajo el precipitado y retirar el PBS.
2. Lisis celular para aislar los núcleos
- Resuspender las células en 40 ml de solución amortiguadora de lisis fría (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) con inhibidores de la proteasa recién añadido (dilución 1:500) y 0,1 mM PMSF. Incubar en una cámara frigorífica con una rotación de 90 minutos, se centrifuga a 2.500 rpm durante 15 minutos, y eliminar el sobrenadante.
3. Restricción de la digestión enzimática con Bgl II
- Resuspender los núcleos en 0,5 ml de un tampón NEB x 3, y añadir 15 μlof 10% SDS. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora con agitación, a continuación, añadir 45 l de 20% de Triton X-100 para capturar la SDS. Se incuba a 37 ° C durante 1 hora con agitación.
- Utilice una alícuota de 1 x 10 6 núcleos (alrededor de 15 mg, una décima parte de las células originales) para la digestión con enzimas de restricción. Saque 55 l de solución de los núcleos de Paso 3.1 y enrasar a 500 ml con 433 l de 1 x tampón NEB 3 y 12 l de Bgl II (50U/ul). Se incuba a 37 ° C durante la noche.
4. La ligadura de segmentos de ADN que interactúan
- Inactivar la enzima de restricción mediante la adición de 95 l de 10% SDS, y se desnaturalizan por calor a 65 ° C durante 20 minutos en un baño de agua.
- 7 ml de un tampón de ligación x (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, MgCl2 10 mM, 10 mM DTT, 1 mM ATP) y 360 l de 20% de Triton X-100 y se incuba a 37 ° C durante 1 hora .
- Baje la temperatura a 16 ° C y añadir 50 l de 400 U / l de ADN ligasa T4. Incubar la muestra a 16 ° C durante 4 horas y después a temperatura ambiente durante 30 minutos.
5. Purificación de ADN
- Añadir 300 mg de proteinasa K, y se incuba a 65 ° C durante la noche.
- Añadir 5 g de RNasa A y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos
- Purificar el ADN por extracción con fenol / cloroformo, y el ADN precipitado con isopropanol. Disolver el ADN en 150 ml de agua destilada estéril.
6. La digestión con Msp I y la ligadura con engarces de oligonucleótidos
- Incubar 2μg de ADN purificado con 5 unidades de Msp I a 37 ° C durante 4-6 horas. Inactivar Msp I a 65 ° C durante 10 minutos, luego precipitar el ADN en etanol con 1 l de 5 mg / ml de glucógeno. Disolver la pastilla de ADN en 50 l de agua destilada estéril.
- Mezclar 50 l de Msp I tratados con ADN con 2 l de una L 20 M oligonucleótido enlazador (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 l de un oligonucleótido S 20 M (5'-cggtgaatc-3'), 1 l de agua destilada estéril y 6 l de 10 x tampón T4 ADN ligasa. Cubrir la mezcla con la cera líquida.
- Oligonucleótidos se desnaturalizan a 50 ° C durante 1 minuto y dejar enfriar de forma gradual a 10 ° C en un 0,5 ° C / minuto gradiente en un termociclador.
- Añadir 1 l de 400 U / l de ADN ligasa T4 y se incuba a 15 ° C durante la noche. Purificar el ADN linker-liga con un kit QIAquick PCR Purificación, y eluyen en 50 l de agua destilada estéril.
7. Amplificación por PCR y análisis de secuencias
- Elija una cartilla de la región específica del ADN que se desea estudiar a larga distancia en las interacciones (es decir, el «cebo»). En este ejemplo, usamos ABL-1.
- Tome 1 l de ADN purificado para llevar a cabo la primera ronda de PCR utilizando un l de 20 M -1 ABL cebadores específicos # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 l de 20 mM imprimación específica enlazador # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl de 3 x Klen polimerasa ADN Taq I cóctel y 3 l de agua destilada estéril. Dos l de 32 P-dCTP se añade a 100 l de 3 x ADN polimerasa Taq I Klen cóctel antes de la amplificación por PCR. El ciclo térmico para un arranque en caliente PCR es de 72 ° C durante 2 min, 95 ° CFOR 2 minutos, 18 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos, 65 ° C durante 40 segundos y 72 ° C durante 1 minuto; la última prórroga se realiza a 72 ° Cdurante 5 minutos.
- Purificar los productos de primera ronda de PCR utilizando un kit QIAquick PCR Purificación, y el ADN se eluyen en 30 l de agua destilada estéril.
- Tome 1 l de 100 x diluida primer producto de PCR para llevar a cabo una segunda ronda de PCR utilizando los cebadores anidados mediante la adición de 1 l de 20 mM ABL-1 cebadores específicos # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (Figura 1a), 1 l de 20 M de imprimación específica enlazador # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 l de 3 x Klen polimerasa ADN Taq I cóctel y 3 l de agua destilada estéril. El calendario de ciclos térmicos es de 25 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos, 67 ° C durante 40 segundos y 72 ° C durante 1 minuto, seguido de la extensión a 72 ° C durante 5 minutos.
- Visualizar los productos de PCR mediante la ejecución de un 5% de urea-PAGE gel y el escaneo de la pantalla expuesta en un PhosphoImager (Figura 1b). Cada banda de PCR pueden ser reciclados a partir del gel mediante la disolución de las bandas de gel en un tubo Eppendorf que contiene 60 l de agua destilada estéril, y la incubación a 95 ° C durante 5 minutos. Centrifugar brevemente a 10.000 rpm durante 10 segundos para recoger todas las muestras. Quitar una l que se utilizará como plantilla de ADN para realizar PCR con el primer par de 2961/4626 con las mismas condiciones como se describió anteriormente. Análisis de la secuencia se puede realizar después de la purificación utilizando un kit QIAquick PCR Purificación.
- Secuencias de ADN se analizó mediante una herramienta en línea para determinar su localización cromosómica en el sitio web: http://genome.ucsc.edu (Figura 1c). Haga clic en "Blat" para entrar en una nueva ventana que permite pegar una secuencia de ADN, aparecerá una nueva ventana después de hacer clic en 'enviar', y muestra los "Resultados de la búsqueda Blat. Haga clic en "browser" de la exitosa con 100% de identidad para entrar en una ventana al lado de mostrar la ubicación de la secuencia de ADN.
8. Resultados representante
1. ACT ensayo utilizando ABL-1 región como cebo para determinar sus interacciones a largo rango de ADN
Como se ilustra en la Figura 1a, dos sitios de Bgl II y un sitio BamH I fueron elegidos para el ensayo de ACT. En la segunda ronda de PCR, primer conjunto 4626/2961 fue utilizado para amplificar ABL-M1, 4630/2961 se utilizó para ABL-M2, y 4636/2961 se utilizó para ABL-M3. Un patrón típico muestra un gel de varias bandas (Figura 1b). Cada fragmento de un ensayo ACT consta de dos segmentos de ADN que combina: un segmento se deriva de la región de ADN cebo, mientras que el segundo segmento proviene del asociado, que se unió al segmento de la región cebo por la secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción primera. La secuencia de la enzima segundo reconocimiento aparecerá al final de la secuencia de los miembros asociados (Figura 1c). El clonado ABL-M1 fragmento contiene ADN de la región de ABL1 localizado en el cromosoma 9q32.4 de +133,592,306-133,592,399, y el miembro asociado, se encuentra en el cromosoma 3p13 de +71,869,882-71,870,107. Las identidades de los miembros asociados son descubiertos por las voladuras de sus secuencias utilizando la UCSC genoma navegador (GRCh7/hg19 lanzado en febrero de 2009). PROK2 fue identificado como el miembro asociado en el locus chr3p13.
Del mismo modo, el socio de ABL-M2 asociados se localizó en chr5q21.1, mientras que el clon ABL-M3 fue identificado como una asociación dentro de los cromosomas, cerca de la ABL-1 locus.
2. La determinación de las interacciones de largo alcance usando menos prevalentes ensayo ACT
Otros ensayos sobre la base de 3C han reportado muchos más socios que interactúan que hemos mostrado en la Figura 1 y en el Igf2 / H19 lugar 12. La metodología que hemos planteado seleccionará las interacciones más frecuentes de largo alcance. Sin embargo, al aumentar el número de ciclos de PCR, es posible identificar las asociaciones adicionales, menos frecuentes, así (Figura 2).
3. Diferencias en las interacciones de largo alcance en las células del cáncer en comparación con tejidos normales.
La prueba ACT también puede ser utilizado para identificar las diferencias en la arquitectura y las interacciones nucleares de largo alcance entre células normales y células cancerosas (Figura 3). Estas diferencias pueden reflejar cambios en la arquitectura nuclear que se producen durante la transformación celular, y por lo tanto este ensayo en última instancia, pueden ser aplicables para fines de diagnóstico. Los patrones de gel similares que ocurren tanto en los tejidos normales y el cáncer se indica que la prueba ACT es confiable y repetible. Mientras que el ensayo ACT puede identificar socios a largo rango de ADN, análisis adicionales, tales como peces y ensayos de chip, están obligados a verificar la presencia de las asociaciones identificadas entre loci lejano. Los estudios genéticos, fisiológicos y bioquímicos se puede llevar a cabo para dilucidar las implicaciones biológicas de estas asociaciones de ADN de largo alcance.
Figura 1 ACT ensayo utilizando ABL-1 región de ADN cebo en células HL-60. a. ADN estructuraUre en ABL-1 región. La enzima de restricción por primera vez en ACT ensayo se Bgl II. Los primers para la segunda ronda de PCR también se etiquetan mediante flechas y números correspondientes de imprimación. b. Gel patrón de la prueba de ACT en el 5% de urea-PAGE. Primer par de 4626/2961 fue utilizado para amplificar el clon de ABL-M1 en la PCR anidada, 4630/2961 se utilizó para clonar ABL-M2, y 4636/2961 se utilizó para clonar ABL-M3. c. La secuencia de ADN del clon ABL-M1. Fragmento de ADN de ABL-1 ADN cebo está etiquetado en rojo, y el socio de ADN asociado tiene la etiqueta de color cyan. Bgl II sitio (AGACTC) fue marcado en verde, y Msp I sitio (CCGG) está marcado en color púrpura.
Figura 2 ciclos de PCR afectar los resultados del ACT ensayo. Uso de la región de control de impresión (ICR) en el locus IGF-2/H19 como cebo de ADN en las células de fibroblastos de ratón, diferentes programas de ciclismo se aplicaron en la primera y segunda ronda de PCR en la prueba de ACT. 18-20 ciclos en la primera ronda de PCR no amplificar la señal lo suficiente como para ser visualizado. Veinte y cinco ciclos en el segundo los resultados de PCR en las bandas claras, mientras que el aumento del número de ciclos para la segunda ronda de PCR inducido por un patrón de tinción, además de más bandas.
Figura 3 La detección de diferencias en la arquitectura nuclear entre el tejido normal del colon y el tejido de cáncer de colon en el ensayo ACT. A. La estructura del ADN de la región ICR en IGF-2/H19 lugar y el gen IGF2. Dpn sitios para el ensayo ACT II son etiquetados. Cebadores utilizados en la segunda ronda de PCR están marcados con flechas y números en diferentes colores que corresponden a cada calle, en el panel B de la figura. b. Gel patrón de la prueba de ACT en el 5% de urea-PAGE. Tejido normal del colon MAD03-1423 y el tejido de cáncer de colon MAD04-149 se obtuvo de la Red Cooperativa de Tejidos Humanos (CHTN) División Oeste. Después de cada tejido del colon se homogeneizó, ensayo ACT se llevó a cabo siguiendo los procedimientos descritos en este documento. Carril 1 representa los resultados de PCR con el primer par # 2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') marcados en color rosa en un panel, carril 2 representa los resultados de PCR con el primer par # 2961 y # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') etiqueta de color naranja en un panel, carril 3 representa los resultados de la PCR con el primer par # 2961 y # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') marcados en azul en el panel de una; carril 4 corresponde a los resultados de PCR con el primer par # 2961 y # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') marcada en verde en el panel de a. Bandas únicas que aparecen sólo en el tejido normal del colon están marcados por flechas amarillas, y esas bandas que apareció sólo en el tejido de cáncer de colon están etiquetados en las flechas rojas. ICR, el control de impresión de la región, DMR, región metilado diferentes.
Discussion
Dekker et al. Desarrolló la conformación de los cromosomas de captura (3C) método para detectar la frecuencia de interacción entre dos loci del genoma 1 y 3C se ha utilizado ampliamente para investigar las asociaciones intra-e inter-cromosómicas cromosómicas entre dos regiones de ADN en células de mamíferos conocidos 2 -9. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus 10-11. Hemos modificado este enfoque para identificar las regiones desconocidas de ADN que están asociados con una región de ADN conocidos en el ratón y células humanas cultivadas (Figura 1). Hemos llamado a este método la trampa cromosómicas asociadas (ACT) de ensayo, ya que nos proporciona un método fiable y reproducible para identificar nuevos socios de ADN desconocido que se asocian con una zona piloto de ADN que se sabe 12. Un ensayo con éxito 3C con los controles adecuados se realiza antes de la ejecución de los aspectos novedosos de la prueba ACT 13. Con el fin de tofind como muchas regiones de ADN asociadas como sea posible, es necesario el uso de varias combinaciones de enzimas de restricción primera y segunda. Es especialmente importante la utilización de enzimas de restricción que son sensibles a la metilación CpG para llevar a cabo el primer paso para la ligadura de 3C. La unión a proteínas y la metilación del ADN también pueden influir en la eficiencia de la enzima de restricción digestión y puede conducir al fracaso de la ligadura de las regiones de ADN asociadas a ciertas digestiones con enzimas de restricción. La aparición de la ligadura de intra o inter-cromosómica depende de la proteína-ADN de entrecruzamiento y apropiado mapas físicos de las dos regiones de ADN asociadas. Por lo tanto, algunos experimentos preliminares son esenciales para establecer una concentración de formaldehído eficaz posible y el tiempo de tratamiento en el ensayo de ACT. Una gama de concentraciones finales de formaldehído (from1.5% a 2%) se han utilizado en varios laboratorios en la parte de 3C de la prueba de 7,9. Por otra parte, los oligonucleótidos utilizados como enlaces pueden ser diseñados para coincidir con el extremo cohesivo cortado por la enzima de restricción segundos. Aunque se encontró que los ciclos de 18-20 en la primera ronda de PCR y los ciclos de 20-25 en la segunda ronda de PCR podría proporcionar bandas claras, es necesario establecer las mejores condiciones de PCR para cada experimento (Figura 2). Intra-molécula recocido entre la secuencia del adaptador extremo 5 'y 3' final complementaria de una cadena de ADN puede ocurrir en la PCR, que inhibe específica del adaptador de primer recocido con la molécula de ADN, y dio lugar a la eficiencia de amplificación mucho menor en el primero de varios ciclos. Después de la meta de ADN fue amplificado por ciclos, su cantidad puede ser mucho mayor que estas reacciones no específicas, y puede facilitar la competencia de primer recocido a las moléculas de ADN diana. Esta es la razón por la que podemos ver a la amplificación de fondo, y por qué el producto la primera ronda de PCR tiene que ser diluida para disminuir amplification.It de fondo es importante para eliminar el exceso de cebadores de la reacción de PCR con el fin de disminuir el fondo en la segunda ronda de PCR. Como en todos los experimentos basados en la PCR, es de vital importancia el diseño de cebadores que no se encuentran en las regiones de secuencia de repetición, que constituyen la mayoría del ADN humano y el ratón. Aunque de nuevo desarrollo Hi-C metodología puede ser aplicada para el estudio de todo el genoma de ADN asociación, ensayo ACT es todavía una técnica eficaz para el estudio de la interacción de ADN específica de locus.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a Adelle Murell y Reik Lobo mucho por compartir su protocolo 3C. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Defensa y el Servicio de Investigación del Departamento de Asuntos de Veteranos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | |
| acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | |
| ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-039 | |
| SDS | Invitrogen | 15525-017 | |
| urea | Invitrogen | 15505-035 | |
| BamH I | New England Biolabs | R0136T | |
| Bgl II | New England Biolabs | R0144M | |
| Dpn II | New England Biolabs | R0543T | |
| Msp I | New England Biolabs | R0106S | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
| proteinase K | New England Biolabs | P8102S | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | |
| proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Nonidet P-40 | Roche Group | 11754599001 | |
| KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | |
| dCTP alpha P32 | PerkinElmer, Inc. | BLU513H250UC | |
| PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | |
| Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | |
| OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |
References
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