Summary
Det tillhörande kromosom fällan (ACT)-analysen är en roman objektiva metod för att identifiera långsiktiga DNA-interaktioner. Karakterisering av långa interaktioner räckvidd DNA ger oss möjlighet att fastställa förhållandet av kärntekniska arkitektur genuttryck i både normal fysiologi och olika sjukdomar.
Abstract
Genetisk information kodas av DNA är organiserat i en komplex och starkt reglerad kromatinstrukturen. Varje kromosom upptar ett visst territorium, som kan ändras beroende på stadium av utveckling eller cellcykeln. Genuttryck kan uppstå i specialiserade transkriptionell fabriker där kromatin segment kan slinga ut från olika kromosom territorier, vilket leder till co-lokalisering av DNA-segment som kan finnas på olika kromosomer eller långt ifrån varandra på samma kromosom. Associated Kromosom Trap (ACT)-analysen ger en effektiv metod för att identifiera dessa långsiktiga DNA-föreningar på ett opartiskt sätt genom att utvidga och modifiera kromosom tekniken konformation fånga. ACT-analysen gör det möjligt för oss att undersöka mekanismerna för transkriptionell reglering i trans, och kan förklara sambandet mellan kärnkraft arkitektur genuttryck i normal fysiologi och vid sjukdomstillstånd.
Protocol
1. Formaldehyd fixering av långväga kromatin interaktioner
- Kultur human cellinje HL-60 i RPMI1640 medium med 15% FBS och 1 x penicillin / streptomycin till 80-90% confluence i en inkubator som levereras med 5% CO 2 vid 37 ° C.
- Samla cellerna i en 50 ml Nunc rör, centrifugera vid 1200 rpm i 15 minuter och ta sedan bort mediet genom aspiration
- Tillsätt 5 ml odlingsmedium för att resuspendera cellen pellets, och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer. Ta ca 1 x 10 7 celler till en volym på 40 ml med RPMI1640 / 10% FBS, tillsätt sedan 1,7 ml 37% formaldehyd att fixa späda kromatin.
- Inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter med försiktig skakning och sedan släcka med 2,4 ml 2M glycin. Centrifugera i 15 minuter vid 1200 rpm vid 4 ° C och avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten gång med 40 ml iskall PBS, då spinn ner pelleten och avlägsna PBS.
2. Cellslys att isolera kärnor
- Resuspendera cellerna i 40 ml iskall lyseringsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl, 0,2% NP-40) med nyligen lagt proteashämmare (1:500 utspädning) och 0,1 mM PMSF. Inkubera i ett kallt rum med rotation i 90 minuter, centrifugera vid 2500 rpm i 15 minuter och avlägsna supernatanten.
3. Restriktionsenzymanalys uppslutning med BGL II
- Resuspendera kärnor i 0,5 ml 1 x NEB buffert 3, och lägg till 15 μlof 10% SDS. Inkubera vid 37 ° C under 1 timme med skakningar, lägg sedan till 45 l 20% Triton X-100 att binda på SDS. Inkubera vid 37 ° C under 1 timme med skakning.
- Använd en alikvot av 1 x 10 6 kärnor (ca 15 mikrogram, en tiondel av de ursprungliga cellerna) för restriktionsenzym matsmältningen. Ta ut 55 ìl av kärnor lösning från steg 3,1 och fyll upp till 500 l med 433 l av 1 x NEB buffert 3 och 12 ìl BGL II (50U/ul). Inkubera vid 37 ° C över natten.
4. Ligatur av samverkande DNA-segment
- Inaktivera begränsningen enzymet genom att tillsätta 95 l på 10% SDS, och förstörs genom upphettning vid 65 ° C i 20 minuter i ett vattenbad.
- Tillsätt 7 ml 1 x ligation buffert (30 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 1 mm ATP) och 360 l 20% Triton X-100 och inkubera vid 37 ° C under 1 timme .
- Sänk temperaturen till 16 ° C och tillsätt 50 ìl av 400 U / l T4 DNA-ligas. Inkubera provet vid 16 ° C i 4 timmar och därefter i rumstemperatur i 30 minuter.
5. DNA-rening
- Tillsätt 300 mikrogram proteinas K, och inkubera vid 65 ° C över natten.
- Tillsätt 5 mikrogram RNase A och inkubera vid 37 ° C i 30 minuter
- Rena DNA med fenol / kloroform utvinning, och fällningen DNA i isopropanol. Lös upp DNA i 150 l sterilt destillerat vatten.
6. Uppslutning med MSP I och ligation med oligonukleotid linkers
- Inkubera 2μg renat DNA med 5 enheter av MSP jag vid 37 ° C i 4-6 timmar. Inaktivera MSP jag vid 65 ° C i 10 minuter, då fällning DNA i etanol med 1 l av 5 mg / ml glykogen. Lös upp DNA pelleten i 50 l sterilt destillerat vatten.
- Blanda 50 ìl av MSP I-behandlade DNA med 2 ìl av en 20 mikroM länkare oligonukleotiden L (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 l av en 20 mikroM oligonukleotid S (5'-cggtgaatc-3'), 1 ìl sterilt destillerat vatten och 6 l 10 x T4 DNA-ligas buffert. Täck blandningen med flytande vax.
- Denaturera oligonukleotider vid 50 ° C i 1 minut och låt svalna gradvis till 10 ° C i en 0,5 ° C / minut gradient i en thermocykelapparat.
- Tillsätt 1 l av 400 U / l T4 DNA-ligas och inkubera vid 15 ° C över natten. Rena länkaren-knyts ihop DNA med en QIAquick PCR Purification kit, och eluera i 50 l sterilt destillerat vatten.
7. PCR-amplifiering och sekvensanalys
- Välj en primer för den specifika region av DNA som man vill undersöka för långväga interaktioner (dvs. den "bete"). I detta exempel använder vi ABL-1.
- Ta 1 ìl av det renade DNA för att utföra den första omgången PCR med hjälp av en ìl av 20 mikroM ABL -1 specifika primer # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 l av 20 mikroM länkare specifika primer # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3), 3μl 3 x Klen Taq DNA-polymeras I cocktail och 3 l sterilt destillerat vatten. Två ìl av 32 P-dCTP läggs till 100 l av 3 x Klen Taq DNA-polymeras jag cocktail innan PCR-amplifiering. Den termiska cykel för en varmstart PCR är 72 ° C under 2 min, 95 ° Cfor 2 minuter, 18 cykler av 95 ° C i 20 sekunder, 65 ° C i 40 sekunder och 72 ° C under 1 minut, den slutliga förlängningen utförs vid 72 ° Ci 5 minuter.
- Rena den första omgången PCR-produkter med en QIAquick PCR Purification kit, och eluera DNA i 30 l sterilt destillerat vatten.
- Ta 1 l på 100 x utspädd first PCR-produkt för att utföra en andra omgång av PCR, med kapslade primers genom att tillsätta 1 ìl av 20 mikroM ABL-1 specifika primer # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (Figur 1a), 1 l av 20 mikroM av länkare specifika primer # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 l 3 x Klen Taq DNA-polymeras I cocktail och 3 l sterilt destillerat vatten. Den termiska cykling Schemat är 25 cykler av 95 ° C i 20 sekunder, 67 ° C i 40 sekunder och 72 ° C under 1 minut, följt av förlängningen vid 72 ° C i 5 minuter.
- Visualisera PCR-produkter genom att köra ett 5% urea-PAGE gel och skanna den exponerade skärmen i en PhosphoImager (Figur 1b). Varje PCR-bandet kan återvinnas från gelen genom att lösa upp gelen remsorna i ett Eppendorf-rör innehållande 60 l sterilt destillerat vatten och inkuberas vid 95 ° C i 5 minuter. Centrifugera kort vid 10.000 rpm i 10 sekunder för att samla alla prover. Ta bort 1 l som ska användas som DNA-mall för PCR med primer paret 2961/4626 enligt samma villkor som beskrivits ovan. Sekvensanalys kan göras efter rening med hjälp av en QIAquick PCR Purification kit.
- DNA-sekvenser analyseras med ett online-verktyg för att fastställa deras kromosomala läge på webbplatsen: http://genome.ucsc.edu (figur 1c). Klicka på "Blat" för att ange ett nytt fönster som gör det möjligt att klistra in en DNA-sekvens, öppnas ett nytt fönster efter att ha klickat på "Skicka" och visar "Blat Sökresultat". Klicka på "i webbläsaren för träffen med 100% identitet för att ange ett nästa fönster för att visa platsen för DNA-sekvens.
8. Representativa resultat
1. ACT-analysen med hjälp av ABL-1 regionen som bete för att bestämma dess långa interaktioner utbud DNA
Som framgår av Figur 1a, två BGL II-lägen och en BamH jag platsen valdes för ACT-analysen. I den andra omgången av PCR, som grundfärg 4626/2961 har använts för att förstärka ABL-M1 var 4630/2961 används för ABL-M2 och 4636/2961 användes för ABL-M3. En typisk gel mönster visar ett av flera band (Figur 1b). Varje fragment från ett ACT-analysen består av två kombinerade DNA-segment: ett segment kommer från betet DNA-regionen, medan det andra segmentet kommer från associerad partner, som var ansluten till bete regionen segmentet av den första restriktionsenzymanalys erkännande sekvens. Den andra enzym erkännande sekvensen kommer att visas i slutet av den associerade partnern sekvensen (Figur 1c). Den klonade ABL-M1 fragment innehåller DNA från regionen ABL1 ligger på kromosom 9q32.4 från +133,592,306-133,592,399, och de associerade partnern ligger på kromosom 3p13 från +71,869,882-71,870,107. Om vilka associerade partner upptäcks genom blästring deras sekvenser med hjälp av UCSC genomet webbläsare (GRCh7/hg19 släpptes i februari 2009). PROK2 identifierades som tillhörande partner på chr3p13 locus.
Likaså var den ABL-M2 associerad partner lokaliserad till chr5q21.1, medan klon ABL-M3 identifierades som en intra-kromosomala förening nära ABL-1 locus.
2. Fastställande mindre vanliga långväga interaktioner med ACT-analysen
Andra analyser baserade på 3C har rapporterat många fler samverkande partners än att vi har visat i figur 1 och vid IGF2 / H19 locus 12. Den metod som vi har beskrivit kommer att välja den vanligaste långväga interaktioner. Men genom att öka antalet PCR-cykler, är det möjligt att identifiera ytterligare, mindre frekventa föreningar samt (Figur 2).
3. Skillnader i långväga interaktioner i cancerceller jämfört med normal vävnad.
ACT-analysen kan också användas för att hitta skillnader i kärn-arkitektur och lång interaktioner varierar mellan normala celler och cancerceller (Figur 3). Dessa skillnader kan avspegla kärnkraft arkitektur förändringar som sker under celltransformation, och därmed den här analysen kan i slutändan vara tillämpliga för diagnostiska ändamål. Den liknar gelé mönster som förekommer i både normala och vävnader cancer visade att ACT-analysen är pålitlig och repeterbar. Medan ACT-analysen kan identifiera långa partners olika DNA, vidare analyser, såsom fisk och analyser chip, är skyldiga att kontrollera närvaron av de identifierade samband mellan avlägsna loci. Genetiska, fysiologiska och biokemiska studier kan då göras för att belysa de biologiska effekterna av dessa långa föreningar räckvidd DNA.
Figur 1 ACT analysen med ABL-1 området som bete DNA i HL-60 celler. A. DNA-structure i ABL-1 regionen. Den första begränsningen enzym som används i ACT-analysen var BGL II. Primers för den andra omgången av PCR är också märkta med pilar och motsvarande siffror primer. b. Gel mönster av ACT test på 5% urea-PAGE. Primer paret 4626/2961 användes för förstärkning klon ABL-M1 i den kapslade PCR var 4630/2961 används för klon ABL-M2 och 4636/2961 användes för klon ABL-M3. C. DNA-sekvens klon ABL-M1. DNA-fragment från ABL-1 bete DNA är märkt i rött, med tillhörande DNA partnern är märkt i cyan. BGL II webbplats (AGACTC) var märkt med grön och MSP jag plats (CCGG) är märkt i lila.
Figur 2 PCR-cykler påverkar ACT analysresultat. Använda regionen imprinting kontroll (ICR) vid Igf2/H19 locus som bete DNA i celler mus fibroblast, var annorlunda cykling program tillämpas i första och andra omgången av PCR i ACT-analysen. 18-20 cykler i den första omgången av PCR inte förstärker tillräckligt signal som skall visualiseras. Tjugofem cykler i det andra PCR-resultat i tydliga band, och samtidigt öka antalet cykler för den andra omgången av PCR-inducerade ett cellprov mönster förutom att fler band.
Figur 3 Detektion av skillnader i kärnkraft arkitektur mellan normala kolon vävnad och tjocktarmscancer vävnad i ACT-analysen. A. DNA-strukturen i ICR regionen IGF2/H19 lokus och IGF2 genen. DPN II platser för ACT-analysen är märkta. Grundfärg som används i den andra omgången PCR är märkta med pilar och siffror i olika färger som motsvarar varje körfält i panel B i figuren. b. Gel mönster av ACT test på 5% urea-PAGE. Normala kolon vävnad MAD03-1423 och tjocktarmscancer vävnad MAD04-149 har erhållits från Kooperativa mänsklig vävnad Network (CHTN) Västra Division. Efter varje kolon vävnad var homogeniserad var ACT-test som utförs enligt de förfaranden som beskrivs häri. Körfält 1 representerar PCR resultaten med grundfärg par # 2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') märkt i rosa i panel en, bana 2 representerar PCR resultaten med grundfärg par # 2961 och # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') märkt i orange i panel en, bana 3 representerar PCR resultaten med grundfärg par # 2961 och # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') märkt i blått i panelen en, bana 4 är den PCR-resultaten med grundfärg par # 2961 och # 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3) är märkta med grön färg i panel a. Unik band som bara visas i normal kolon vävnad är märkta med gula pilar, och de band som endast visades på tjocktarmscancer vävnad är märkta i rött pilar. ICR, imprinting kontroll region, DMR, olika denaturerad regionen.
Discussion
Dekker et al. Utvecklat kromosomen konformation capture (3C) metod för att upptäcka förekomsten av interaktion mellan två genomiska lokus 1 och 3C har använts i stor omfattning för att undersöka intra-kromosom-och inter-kromosomala associationer mellan två kända DNA-regioner i däggdjursceller 2 -9. Även nyutvecklade Hi-C metoden kan användas för studier av arvsmassan hela DNA-förening, är ACT-analysen fortfarande en effektiv teknik för studier av locus-specifika DNA-interaktion 10-11. Vi har modifierat denna metod för att identifiera okända DNA-regioner som är förknippade med en känd DNA-region i odlade mus och humana celler (Figur 1). Vi döpte denna metod tillhörande kromosomen fällan (ACT)-analysen, eftersom det gett oss en pålitlig och reproducerbar metod för att identifiera nya okända DNA-partners som förknippar med en känd mål-DNA regionen 12. En framgångsrik 3C-analysen med lämpliga kontroller görs innan den nya aspekter av ACT-analysen 13. För tofind så många associerade DNA-regioner som möjligt är det nödvändigt att använda olika kombinationer av första och andra begränsning enzymer. Det är särskilt viktigt att använda restriktionsenzymer som är okänsliga för CpG metylering genomföra de första 3C ligering steg. Proteinbindning och DNA-metylering kan också påverka begränsning effektivitet enzym matsmältningen och kan leda till fel i ligation de associerade DNA-regioner för vissa digestions restriktionsenzym. Förekomsten av intra-och inter-kromosomal ligation beror på protein-DNA tvärbindning och lämpliga fysiska kartor över både de associerade DNA-regioner. Således några preliminära experiment nödvändigt att skapa en praktiskt effektiv formaldehyd koncentration och behandlingstiden i ACT-analysen. En rad slutliga koncentrationer formaldehyd (from1.5% till 2%) har använts i flera laboratorier under 3C delen av analysen 7,9. Alternativt kan oligonukleotider används som linkers vara utformade för att matcha sammanhållande ändskär av den andra begränsningen enzymet. Även om vi funnit att 18-20 cykler i den första omgången av PCR och 20-25 cykler i den andra omgången av PCR kan ge tydliga band, är det nödvändigt att fastställa de bästa PCR-förhållanden för varje experiment (figur 2). Intra-molekyl glödgning mellan 5'-änden och 3'-änden kompletterande adaptern sekvens av en DNA-sträng kan uppstå i PCR, hämmar det adapter-specifik primer glödgning med DNA-molekylen, och resulterade i mycket lägre förstärkning effektivitet i de första omgångarna. Efter mål-DNA förstärktes för cyklar, kan dess belopp vara mycket större än dessa ospecifika reaktioner, och kan underlätta konkurrens primer glödgning till molekyler mål-DNA. Det är också därför vi kan se bakgrunden förstärkning, och varför den första omgången PCR-produkten måste spädas för att minska bakgrunden amplification.It är viktigt att avlägsna överskott av primers från PCR-reaktionen för att minska bakgrunden i den andra omgången av PCR. Som i alla PCR-experiment är det viktigt att designa primers som inte är belägna i områden repetera sekvens, som utgör majoriteten av mänskliga och mus DNA. Även nyutvecklade Hi-C metoden kan användas för studier av arvsmassan hela DNA-förening, är ACT-analysen fortfarande en effektiv teknik för studier av locus-specifika DNA-interaktion.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Adelle Murell och Wolf Reik mycket för att dela sina 3C protokollet. Detta arbete stöddes av försvarsdepartementet och Research Service av Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | |
| acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | |
| ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-039 | |
| SDS | Invitrogen | 15525-017 | |
| urea | Invitrogen | 15505-035 | |
| BamH I | New England Biolabs | R0136T | |
| Bgl II | New England Biolabs | R0144M | |
| Dpn II | New England Biolabs | R0543T | |
| Msp I | New England Biolabs | R0106S | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
| proteinase K | New England Biolabs | P8102S | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | |
| proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Nonidet P-40 | Roche Group | 11754599001 | |
| KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | |
| dCTP alpha P32 | PerkinElmer, Inc. | BLU513H250UC | |
| PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | |
| Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | |
| OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |
References
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
- Apostolou, E., Thanos, D. Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression. Cell. 134, 85-96 (2008).
- Duan, Z. A three-dimensional model of the yeast genome. Nature. 465, 363-367 (2010).
- Lomvardas, S. Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell. 126, 403-413 (2006).
- Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet. 36, 889-893 (2004).
- Schoenfelder, S. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat Genet. 42, 53-61 (2010).
- Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature. 435, 637-645 (2005).
- Vakoc, C. R. Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. Mol Cell. 17, 453-462 (2005).
- Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation. Science. 311, 1149-1152 (2006).
- Lieberman-Aiden, E. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Berkum, N. L. van Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. J Vis Exp. , (2010).
- Ling, J. Q. CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1. Science. 312, 269-272 (2006).
- Dekker, J. The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods. 3, 17-21 (2006).
