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Biology

लंबी दूरी की डीएनए सहभागिता की पहचान के लिए एसोसिएटेड क्रोमोजोम जाल

doi: 10.3791/2621 Published: April 23, 2011

Summary

संबद्ध गुणसूत्र जाल परख (अधिनियम) लंबी दूरी की डीएनए बातचीत की पहचान करने के लिए एक उपन्यास विधि निष्पक्ष है. लंबी दूरी डीएनए बातचीत के लक्षण वर्णन हमें दोनों सामान्य शरीर विज्ञान में और रोगग्रस्त राज्यों में परमाणु वास्तुकला का संबंध जीन की अभिव्यक्ति के लिए निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा.

Abstract

आनुवंशिक डीएनए द्वारा इनकोडिंग जानकारी एक जटिल और उच्च विनियमित chromatin संरचना में आयोजित किया जाता है. प्रत्येक गुणसूत्र के एक विशिष्ट क्षेत्र में रह रहे हैं, कि विकास की अवस्था या कोशिका चक्र के अनुसार बदल सकते हैं. जीन अभिव्यक्ति विशेष transcriptional कारखानों में हो सकता है जहां chromatin क्षेत्रों गुणसूत्र के विभिन्न प्रदेशों से बाहर पाश डीएनए खंडों जो अलग या एक ही गुणसूत्र पर गुणसूत्रों दूर पर मौजूद हो सकता है की सह स्थानीयकरण करने के लिए अग्रणी हो सकता है. एसोसिएटेड क्रोमोजोम ट्रैप परख (अधिनियम) एक प्रभावी पद्धति के विस्तार और गुणसूत्र रचना पर कब्जा तकनीक को संशोधित करके इन लंबी दूरी की एक निष्पक्ष फैशन में डीएनए संघों की पहचान प्रदान करता है. अधिनियम परख के लिए यह संभव बनाता है हमें ट्रांस में transcriptional विनियमन के तंत्र की जांच करने के लिए, और परमाणु वास्तुकला का सामान्य और रोग राज्यों के दौरान शरीर क्रिया विज्ञान में जीन अभिव्यक्ति के रिश्ते को समझाने में मदद कर सकते हैं.

Protocol

1. लंबी दूरी की chromatin बातचीत के Formaldehyde निर्धारण

  1. संस्कृति 15% FBS और एक मशीन में 1 x पेनिसिलिन / संगम 80-90% स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मानव कोशिका लाइन RPMI1640 माध्यम HL-60 37 पर 5% सीओ 2 के साथ आपूर्ति की डिग्री सेल्सियस
  2. 15 मिनट के लिए 1200 rpm पर, एक 50 मिलीलीटर Nunc ट्यूब, अपकेंद्रित्र में कोशिकाओं लीजिए और तब आकांक्षा द्वारा मध्यम हटायें
  3. सेल छर्रों, और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं गिनती resuspend मध्यम संस्कृति के 5 मिलीलीटर जोड़ें. / 10 RPMI1640% FBS के साथ 40 मिलीलीटर की एक मात्रा के लिए लगभग 1 x 10 7 कोशिकाओं को ले लो, तो 37% formaldehyde के 1.7 मिलीलीटर जोड़ने पतला chromatin तय है.
  4. कोमल झटकों के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं, और तब 2M ग्लाइसिन के 2.4 मिलीलीटर के साथ बुझाना. 1200 rpm पर 15 मिनट के लिए 4 में अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस, और सतह पर तैरनेवाला हटायें. गोली 40 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस के साथ एक बार धो, तो नीचे गोली स्पिन और पीबीएस हटायें.

2. प्रकोष्ठ को नाभिक अलग lysis

  1. बर्फ हौसले से जोड़ा protease inhibitors (कमजोर पड़ने 1:500) और 0.1 मिमी PMSF के साथ ठंड lysis बफर (10 मिमी Tris - एचसीएल, pH8.0, 10 मिमी NaCl, 0.2% एनपी 40) के 40 मिलीलीटर में Resuspend कोशिकाओं. रोटेशन के साथ एक ठंडे कमरे में 90 मिनट, 15 मिनट के लिए 2500 rpm पर अपकेंद्रित्र के लिए सेते हैं, और सतह पर तैरनेवाला हटायें.

3. प्रतिबंध एंजाइम पाचन BGL द्वितीय के साथ

  1. X 1 चंचु 3 बफर के 0.5 मिलीलीटर में नाभिक Resuspend, और 15 μlof 10% एसडीएस जोड़ने. 1 घंटे के लिए 37 ° C पर झटकों के साथ सेते हैं, तो 20% 45 μl जोड़ने ट्राइटन X-100 एसडीएस पृथक. झटकों के साथ डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए 37 सेते हैं.
  2. 1 x 6 प्रतिबंध एंजाइम पाचन के लिए 10 नाभिक (के बारे में 15 μg, मूल कोशिकाओं का दसवां) का एक विभाज्य का उपयोग करें. नाभिक समाधान के 55 μl 3.1 चरण से बाहर ले लो और 500 μl x 1 चंचु 3 बफर और BGL द्वितीय (50U/ul) के 12 μl के 433 μl के साथ . 37 में डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.

4. बातचीत डीएनए खंडों के Ligation

  1. हीटिंग द्वारा 65 पर 10% एसडीएस की 95, μl और denature ° सी एक पानी के स्नान में 20 मिनट के लिए. जोड़ने द्वारा प्रतिबंध एंजाइम को निष्क्रिय
  2. X 1 ligation (30 Tris - एचसीएल मिमी, 8.0 पीएच, 10 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी डीटीटी, 1 मिमी एटीपी) बफर और 20% Triton एक्स-100 की 360 μl के 7 मिलीलीटर जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस सेते 1 घंटे के लिए .
  3. 16 से कम तापमान डिग्री सेल्सियस और 400 यू / μl टी -4 डीएनए ligase के 50 μl जोड़ें. 16 ° C से कम 4 घंटे के लिए नमूना और सेते हैं तो 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर.

5. डीएनए शुद्धीकरण

  1. Proteinase कश्मीर के 300 μg जोड़ें, और 65 में डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
  2. एक और 37 में सेते ° 30 मिनट के लिए सी RNase के 5 μg जोड़ें
  3. Phenol / क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण, isopropanol में और वेग डीएनए से डीएनए शुद्ध. बाँझ आसुत जल के 150 μl में डीएनए भंग.

6. MSP मैं के साथ पाचन और oligonucleotide linkers के साथ ligation

  1. MSP मैं 5 इकाइयों के साथ डीएनए 37 में 4-6 घंटे के लिए डिग्री सेल्सियस शुद्ध के 2μg सेते हैं . मैं 65 में एमएसपी निष्क्रिय ° सी 10 मिनट के लिए, तो 1 5 ग्लाइकोजन मिलीग्राम / एमएल के μl के साथ इथेनॉल में डीएनए वेग . बाँझ आसुत जल का 50 μl में डीएनए गोली भंग.
  2. एक 20 सुक्ष्ममापी linker oligonucleotide एल के 2 μl साथ MSP डीएनए मैं इलाज के 50 μl मिक्स (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), एक 20 सुक्ष्ममापी oligonucleotide (5'-cggtgaatc-3 एस के 1 μl'), 1 की μl बाँझ आसुत जल और 6 x 10 टी -4 डीएनए ligase बफर के μl. तरल मोम के साथ मिश्रण कवर.
  3. पर denature oligonucleotides 50 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस के लिए एक थर्मल cycler में 0.5 ° ढाल सी / मिनट में 1 मिनट और 10 से नीचे धीरे - धीरे शांत अनुमति के लिए.
  4. यू 400 / μl टी -4 डीएनए ligase के एक μl जोड़ें और 15 ° रातोंरात सी सेते. Linker-ligated एक QIAquick पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर, डीएनए, और बाँझ आसुत जल का 50 μl में elute शुद्ध.

7. पीसीआर प्रवर्धन और विश्लेषण अनुक्रम

  1. डीएनए है कि आप लंबी दूरी की बातचीत (यानी, 'चारा') के लिए जांच की इच्छा के विशिष्ट क्षेत्र के लिए एक किताब चुनें. इस उदाहरण में, हम ABL-1 का उपयोग करें.
  2. शुद्ध डीएनए के एक μl ले लो करने के लिए पहले दौर 20 सुक्ष्ममापी 1 की μl का उपयोग ABL -1 विशिष्ट प्राइमर # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 20 सुक्ष्ममापी 1 की μl linker विशिष्ट प्राइमर 2963 # (पीसीआर प्रदर्शन 5'- 'gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3), 3 एक्स Klen Taq डीएनए पोलीमरेज़ मैं कॉकटेल और बाँझ आसुत जल के 3 μl के 3μl. पी dCTP 32 के दो μl पीसीआर प्रवर्धन से पहले 3 एक्स Klen Taq डीएनए पोलीमरेज़ मैं कॉकटेल के 100 μl जोड़ा जाता है . अंतिम विस्तार 95 के 18 चक्रों ° सी 20 सेकंड के लिए, 65 ° 40 सेकंड के लिए सी, और 72 डिग्री सेल्सियस के लिए 1 मिनट के लिए, एक गर्म शुरू पीसीआर के लिए थर्मल चक्र 72 ° सी 2 मिनट, 95 ° Cfor 2 मिनट है 72 में प्रदर्शन किया है डिग्री सेल्सियस5 मिनट के लिए.
  3. पहले दौर पीसीआर उत्पादों का उपयोग कर बाँझ आसुत जल का 30 μl में एक QIAquick पीसीआर शोधन किट, और elute डीएनए शुद्ध.
  4. 1 100 1 20 सुक्ष्ममापी की μl ABL एक विशिष्ट प्राइमर (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3) 4626 (चित्रा 1a), 1 μl जोड़कर नेस्टेड प्राइमरों का उपयोग करते हुए पीसीआर के दूसरे दौर में प्रदर्शन के लिए पहली पीसीआर उत्पाद पतला एक्स के μl ले लो linker विशिष्ट प्राइमर # २,९६१ (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 एक्स Klen Taq डीएनए पोलीमरेज़ मैं कॉकटेल और 3 बाँझ आसुत जल के μl 3 μl के 20 सुक्ष्ममापी. थर्मल साइकिल अनुसूची 95 के 25 चक्रों डिग्री सी 20 सेकंड के लिए, 67 ° 40 सेकंड के लिए सी, और 72 ° C 1 मिनट, 5 मिनट के लिए 72 ° C पर विस्तार से बाद के लिए.
  5. एक 5% यूरिया पृष्ठ जेल में चल रहा है और एक PhosphoImager में उजागर स्क्रीन (चित्रा 1b) स्कैनिंग द्वारा पीसीआर उत्पादों कल्पना. प्रत्येक पीसीआर बैंड एक Eppendorf बाँझ आसुत जल का 60 μl युक्त ट्यूब में जेल स्ट्रिप्स भंग, और 95 ° 5 मिनट के लिए सी में incubating द्वारा जेल से पुनर्नवीनीकरण किया जा सकता है. 10 से सभी नमूनों को इकट्ठा सेकंड के लिए 10,000 rpm पर संक्षिप्त अपकेंद्रित्र. 1 μl डीएनए टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने के लिए प्राइमर जोड़ी 2961/4626 ऊपर वर्णित के रूप में एक ही शर्तों का उपयोग कर के साथ पीसीआर प्रदर्शन निकालें. अनुक्रम विश्लेषण एक QIAquick पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर शुद्धि के बाद किया जा सकता है है.
  6. Http://genome.ucsc.edu (चित्रा -1 सी): डीएनए अनुक्रम विश्लेषण कर रहे हैं एक ऑनलाइन उपकरण का उपयोग करने के लिए अपनी वेब साइट पर गुणसूत्र स्थान निर्धारित है. 'BLAT' पर क्लिक करें जो एक डीएनए अनुक्रम चिपकाने की अनुमति देता है एक नई विंडों में प्रवेश करने के लिए, एक नई विंडों क्लिक 'submit' के बाद प्रकट होता है, और 'BLAT खोज परिणाम' से पता चलता है. 100% पहचान के साथ हिट करने के लिए एक अगली विंडो में प्रवेश करने के लिए डीएनए अनुक्रम के स्थान को दिखाने के क्लिक करें 'ब्राउज़र'.

8. प्रतिनिधि परिणाम

1. चारे के रूप में ABL - एक क्षेत्र का उपयोग करने के लिए अपनी लंबी दूरी के डीएनए बातचीत का निर्धारण अधिनियम परख

जैसा चित्र 1a, दो BGL द्वितीय साइटों और एक BamH साइट मैं में सचित्र अधिनियम परख के लिए चुने गए हैं . पीसीआर के दूसरे दौर में, किताब सेट 4626/2961 ABL-M1 बढ़ाना इस्तेमाल किया गया था, 4630/2961 ABL-M2 के लिए इस्तेमाल किया गया था, और 4636/2961 ABL-M3 के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक ठेठ जेल पैटर्न कई बैंड (चित्रा 1b) के लिए एक से पता चलता है. एक अधिनियम परख से प्रत्येक टुकड़ा दो संयुक्त डीएनए खंडों के होते हैं: एक खंड चारा डीएनए क्षेत्र से ली गई है, जबकि दूसरे खंड जुड़े साथी, जो पहली प्रतिबंध एंजाइम मान्यता अनुक्रम द्वारा चारा क्षेत्र खंड को शामिल किया गया था से आता है. दूसरा एंजाइम मान्यता अनुक्रम जुड़े साथी अनुक्रम (चित्रा -1 सी) के अंत में दिखाई देगा. ABL-M1 क्लोन टुकड़ा ABL1 +133,592,306-133,592,399 से 9q32.4 गुणसूत्र पर स्थित के क्षेत्र से डीएनए होते हैं, और जुड़े साथी +71,869,882-71,870,107 से गुणसूत्र 3p13 पर स्थित है. जुड़े भागीदारों की पहचान अपने दृश्यों को नष्ट करना UCSC जीनोम ब्राउज़र (GRCh7/hg19 फरवरी में जारी की, 2009) का उपयोग करके खोज कर रहे हैं PROK2 chr3p13 बिन्दुपथ में जुड़े साथी के रूप में पहचान की थी.

इसी तरह, ABL-M2 जुड़े साथी chr5q21.1 के लिए स्थानीयकृत किया गया था, जबकि ABL-एम 3 क्लोन अंतर गुणसूत्र ABL 1-बिन्दुपथ के पास एक संघ के रूप में पहचान की थी.

2. कम प्रचलित लंबी दूरी अधिनियम परख का उपयोग कर बातचीत का निर्धारण

3C पर आधारित अन्य assays कई और अधिक बातचीत भागीदारों की तुलना में हम चित्रा 1 में और Igf2 / 12 ठिकाना H19 पर पता चला है की सूचना दी है . पद्धति है कि हम रेखांकित किया है सबसे अधिक प्रचलित लंबी दूरी की बातचीत का चयन करेंगे. हालांकि, पीसीआर चक्र की संख्या को बढ़ाने के द्वारा, यह संभव है करने के लिए अतिरिक्त, कम अक्सर संघों की पहचान के रूप में अच्छी तरह से (चित्रा 2).

3. जब सामान्य ऊतकों की तुलना में कैंसर की कोशिकाओं में लंबी दूरी की बातचीत में अंतर.

अधिनियम परख भी परमाणु वास्तुकला में और सामान्य कोशिकाओं और कैंसर की कोशिकाओं (चित्रा 3) के बीच मतभेद को लंबी दूरी की बातचीत की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन मतभेदों को परमाणु वास्तुकला परिवर्तन है कि सेल परिवर्तन के दौरान होने को प्रतिबिंबित कर सकते हैं, और इस प्रकार इस परख अंततः नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए लागू किया जा सकता है. इसी तरह जेल पैटर्न है कि दोनों सामान्य और कैंसर ऊतकों में होने का संकेत दिया है कि अधिनियम परख विश्वसनीय और repeatable है. जबकि अधिनियम परख लंबी दूरी डीएनए भागीदारों, आगे विश्लेषण जैसे मछली और चिप assays, दूर loci के बीच संघों की पहचान की उपस्थिति की पुष्टि की आवश्यकता की पहचान कर सकते हैं. जेनेटिक शारीरिक, और जैव रासायनिक अध्ययन तो इन लंबी दूरी डीएनए संघों के जैविक प्रभाव स्पष्ट किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 अधिनियम परख चारा डीएनए के रूप में HL-60 कोशिकाओं में ABL - एक क्षेत्र का उपयोग कर. ए डीएनए structABL-1 क्षेत्र में ure. पहली प्रतिबंध अधिनियम परख में इस्तेमाल एंजाइम BGL द्वितीय था. प्राइमरों पीसीआर के दूसरे दौर के लिए भी तीर और इसी प्राइमर संख्या द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. ज. 5% यूरिया पृष्ठ में अधिनियम परख की जेल पैटर्न. प्राइमर जोड़ी 4626/2961 नेस्टेड पीसीआर में ABL-M1 amplifying के क्लोन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, 4630/2961 ABL-M2 क्लोन के लिए इस्तेमाल किया गया था, और 4636/2961 ABL-एम 3 क्लोन के लिए इस्तेमाल किया गया था. सी. ABL-M1 के क्लोन के डीएनए अनुक्रम. ABL-1 चारा डीएनए से डीएनए टुकड़ा लाल रंग में लेबल है, और संबद्ध डीएनए साथी सियान में लेबल है BGL द्वितीय साइट (AGACTC) हरे रंग में चिह्नित किया गया, और एमएसपी साइट मैं (CCGG) बैंगनी में लेबल है.

चित्रा 2
चित्रा 2 पीसीआर चक्र अधिनियम परख परिणामों को प्रभावित माउस fibroblast कोशिकाओं में चारा डीएनए के रूप Igf2/H19 ठिकाना में imprinting नियंत्रण क्षेत्र (ICR) का उपयोग करना. पीसीआर के अधिनियम परख में पहले और दूसरे दौर में, अलग साइकिल चालन कार्यक्रम लागू किया गया . पीसीआर के पहले दौर में 18-20 चक्रों visualized किया जा करने के लिए पर्याप्त संकेत नहीं बढ़ाना था. बीस स्पष्ट बैंड में दूसरा पीसीआर परिणामों में पांच चक्र, जबकि पीसीआर के दूसरे दौर के लिए चक्रों की संख्या में वृद्धि अधिक बैंड के अलावा में एक धब्बा पैटर्न प्रेरित किया.

चित्रा 3
चित्रा 3 परमाणु वास्तुकला में सामान्य बृहदान्त्र ऊतक और अधिनियम परख में पेट के कैंसर ऊतकों के बीच मतभेद की जांच. a. ICR क्षेत्र के IGF2/H19 ठिकाना और IGF2 जीन डीएनए संरचना. DPN अधिनियम परख के लिए द्वितीय साइटों लेबल रहे हैं . दूसरे दौर पीसीआर में इस्तेमाल प्राइमर्स तीर और अलग अलग रंग की संख्या में जो आंकड़ा के पैनल ख में प्रत्येक लेन अनुरूप द्वारा चिह्नित कर रहे हैं. ज. 5% यूरिया पृष्ठ में अधिनियम परख की जेल पैटर्न. सामान्य बृहदान्त्र ऊतक MAD03 +१४२३ और पेट के कैंसर ऊतक MAD04 149 सहकारी मानव ऊतक नेटवर्क (CHTN) पश्चिमी प्रभाग से प्राप्त हुई थी. के बाद प्रत्येक बृहदान्त्र ऊतक homogenized गया था, अधिनियम परख के साथ साथ वर्णित प्रक्रियाओं का पालन किया गया था. 1 लेन पीसीआर प्राइमर जोड़ी # 4161 # 2961and (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 ') पैनल में गुलाबी में लेबल का उपयोग कर परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है, लेन 2 पीसीआर प्राइमर जोड़ी 2961 # और # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 का उपयोग कर परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है ') के पैनल एक नारंगी में लेबल, 3 लेन पीसीआर परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है प्राइमर जोड़ी 2961 # और # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 का उपयोग कर') पैनल में नीले रंग में लेबल, 4 लेन पीसीआर परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है प्राइमर जोड़ी # 2961 का उपयोग और +५१५१ # (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') पैनल ए में हरे रंग में लेबल अद्वितीय बैंड है कि सामान्य बृहदान्त्र के ऊतकों में ही दिखाई पीले तीर द्वारा चिह्नित कर रहे हैं, और उन बैंड है कि पेट के कैंसर ऊतकों में ही दिखाई लाल तीर में चिह्नित कर रहे हैं. ICR, नियंत्रण imprinting क्षेत्र; DMR, विभिन्न methylated क्षेत्र.

Discussion

डेकर एट अल. गुणसूत्र रचना कब्जा दृष्टिकोण (3C) विकसित करने के लिए दो जीनोमिक loci 1 के बीच बातचीत की आवृत्ति का पता लगाने, और 3C बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है दो स्तनधारी 2 कोशिकाओं में ज्ञात डीएनए क्षेत्रों के बीच अंतर गुणसूत्र और अंतर - गुणसूत्र संघों की जांच -9. हालांकि नव विकसित हाय - सी पद्धति जीनोम चौड़ा डीएनए संघ के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, अधिनियम परख अभी भी ठिकाना विशिष्ट डीएनए 10-11 बातचीत के अध्ययन के लिए एक प्रभावी तकनीक है. हम इस दृष्टिकोण को संशोधित किया है कि सभ्य माउस और मानव कोशिकाओं (चित्रा 1) में एक ज्ञात डीएनए क्षेत्र के साथ जुड़े रहे हैं अज्ञात डीएनए क्षेत्रों की पहचान. हम जुड़े गुणसूत्र जाल परख (अधिनियम) इस पद्धति का नाम है, क्योंकि यह हमें एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि उपन्यास अज्ञात डीएनए भागीदार है कि एक ज्ञात लक्ष्य डीएनए 12 क्षेत्र के साथ सहयोगी की पहचान प्रदान की. उचित नियंत्रण के साथ एक सफल 3C परख अधिनियम 13 परख के उपन्यास पहलुओं को क्रियान्वित करने से पहले किया जाता है. कई संभव के रूप में जुड़े डीएनए क्षेत्रों के रूप में tofind क्रम में, यह पहली और दूसरी प्रतिबंध एंजाइमों के विभिन्न संयोजनों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. यह विशेष रूप से प्रतिबंध एंजाइमों कि CPG मेथिलिकरण के लिए असंवेदनशील पहली 3C ligation कदम प्रदर्शन कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटीन बंधन और डीएनए मेथिलिकरण भी प्रतिबंध एंजाइम पाचन दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं और जुड़े कुछ प्रतिबंध एंजाइम digestions के लिए डीएनए क्षेत्रों के ligation की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अंतर या अंतर - गुणसूत्र ligation की घटना प्रोटीन डीएनए पार से जोड़ने और जुड़े डीएनए क्षेत्रों में दोनों के उचित शारीरिक नक्शे पर निर्भर करता है. इस प्रकार, कुछ प्रारंभिक प्रयोगों अधिनियम परख में एक साध्य प्रभावी formaldehyde एकाग्रता और उपचार समय की स्थापना के लिए आवश्यक हैं. Formaldehyde (from1.5% से 2%) के अंतिम सांद्रता का एक सीमा 7,9 परख के 3C भाग के दौरान कई प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है. वैकल्पिक रूप से, linkers के रूप में इस्तेमाल किया oligonucleotides एकजुट दूसरी प्रतिबंध एंजाइम द्वारा काट अंत मैच बनाया जा सकता है है. हालांकि हमने पाया है कि पीसीआर के दूसरे दौर में पीसीआर और 20-25 चक्र के पहले दौर में 18-20 चक्र स्पष्ट बैंड प्रदान कर सकता है, यह आवश्यक है कि प्रत्येक प्रयोग (चित्रा 2) के लिए सबसे अच्छा पीसीआर स्थितियों स्थापित इंट्रा अणु. 5'-अंत और 3'अंत एक कतरा डीएनए पीसीआर में हो सकता है की पूरक एडाप्टर अनुक्रम के बीच annealing एडाप्टर विशिष्ट डीएनए अणु के साथ annealing प्राइमर रोकता है, और पहले कई चक्रों में बहुत कम प्रवर्धन दक्षता में हुई. बाद लक्ष्य डीएनए चक्र के लिए परिलक्षित किया गया था, अपनी राशि ज्यादा इन nonspecific प्रतिक्रियाओं से भी बड़ा हो, और हो सकता है प्राइमर लक्ष्य डीएनए अणु के लिए annealing की प्रतियोगिता की सुविधा हो सकती है. यह भी है इसलिए हम पृष्ठभूमि प्रवर्धन देखते हैं, कर सकते हैं और पहले दौर पीसीआर उत्पाद पृष्ठभूमि amplification.It कमी पतला हो गया है महत्वपूर्ण है के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया से अधिक प्राइमरों को हटाने क्रम में पीसीआर के दूसरे दौर में पृष्ठभूमि में कमी क्यों है. सभी पीसीआर आधारित प्रयोगों के रूप में, यह महत्वपूर्ण है कि दोहराने अनुक्रम क्षेत्रों, जो मानव और चूहे डीएनए के बहुमत का गठन में स्थित नहीं हैं प्राइमरों डिजाइन. हालांकि नव विकसित हाय - सी पद्धति जीनोम चौड़ा डीएनए संघ के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, अधिनियम परख अभी भी ठिकाना विशिष्ट डीएनए बातचीत के अध्ययन के लिए एक प्रभावी तकनीक है.

Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

हम Adelle Murell और वुल्फ Reik उनके 3C प्रोटोकॉल साझा करने के लिए बहुत बहुत धन्यवाद. इस काम के रक्षा और दिग्गजों मामलों के विभाग के अनुसंधान सेवा के विभाग द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI1640 medium Invitrogen 22400-105
acrylamide Invitrogen 15512-023
ATP solution, 10mM Invitrogen AM8110G
fetal bovine serum Invitrogen 16000-044
penicillin-streptomycin Invitrogen 15140-122
1M Tris pH8.0 Invitrogen AM9856
RNase A Invitrogen 12091-039
SDS Invitrogen 15525-017
urea Invitrogen 15505-035
BamH I New England Biolabs R0136T
Bgl II New England Biolabs R0144M
Dpn II New England Biolabs R0543T
Msp I New England Biolabs R0106S
dNTPs New England Biolabs N0447L
proteinase K New England Biolabs P8102S
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202T
37% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Bis-acrylamide Sigma-Aldrich 146072
dithiothreitol Sigma-Aldrich 43815
glycine Sigma-Aldrich 50046
PMSF Sigma-Aldrich 93482
proteinase inhibitor Sigma-Aldrich S8830
Nonidet P-40 Roche Group 11754599001
KlenTaq1 Ab peptides 1001
dCTP alpha P32 PerkinElmer, Inc. BLU513H250UC
PTC-100 Thermal Cycler MJ Research mjptc100
Power Supply Bio-Rad 164-5056
OmniPAGE Maxi Aurogene Life Science VS20D
Typhoon 9400 GE Healthcare 63-0055-78

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References

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Ling, J., Hoffman, A. R. Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions. J. Vis. Exp. (50), e2621, doi:10.3791/2621 (2011).More

Ling, J., Hoffman, A. R. Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions. J. Vis. Exp. (50), e2621, doi:10.3791/2621 (2011).

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