Summary
Связанные хромосомы ловушку (ACT) анализа является роман беспристрастный метод идентификации дальних взаимодействий ДНК. Характеристика долго взаимодействий ДНК диапазон позволит нам определить отношения ядерного архитектуры экспрессии генов в обоих нормальной физиологии, а в больной государств.
Abstract
Генетическая информация, закодированная в ДНК организована в сложной и строго регулируется структуры хроматина. Каждая хромосома занимает определенную территорию, которая может меняться в зависимости от стадии развития или клеточного цикла. Экспрессия генов может происходить в специальных транскрипционных фабриках, где хроматина сегменты могут петля из различных территорий хромосомы, ведущие к совместной локализации участков ДНК, которые могут существовать на разных хромосомах или далеко друг от друга на одной хромосоме. Связанные хромосомы Trap (ACT), препарат обеспечивает эффективную методологию для идентификации этих дальних ДНК объединений в беспристрастной моды, расширяя и изменяя захвата хромосомы конформации техники. Анализ ACT позволяет нам исследовать механизмы регуляции транскрипции в транс, и может помочь объяснить связь ядерной архитектуры экспрессии генов в нормальной физиологии и во время болезненных состояний.
Protocol
1. Формальдегид фиксации дальних взаимодействий хроматина
- Культура человека клеточной линии HL-60 в RPMI1640 среде с 15% FBS и 1 х пенициллина / стрептомицина до 80-90% слияния в инкубатор поставляется с 5% CO 2 при температуре 37 ° C.
- Сбор клеток в 50-мл Nunc трубки, центрифуге при 1200 оборотов в минуту в течение 15 минут, а затем удалить среде стремление
- Добавьте 5 мл культуральной среды для ресуспендирования ячейки гранул, и подсчитать клетки, используя гемоцитометра. Возьмите примерно 1 х 10 7 клеток в объеме 40 мл с RPMI1640 / 10% FBS, затем добавьте 1,7 мл 37% формальдегида исправить разбавленный хроматина.
- Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 минут с осторожном встряхивании, а затем погасить с 2,4 мл 2 М глицина. Центрифуга течение 15 минут при 1200 оборотов в минуту при температуре 4 ° С, и удалите супернатант. Вымойте гранул раз с 40 мл ледяной PBS, то спином вниз гранул и удалить PBS.
2. Лизиса клеток, чтобы изолировать ядер
- Ресуспендируют клеток в 40 мл ледяной буфера для лизиса (10 мМ Трис-HCl, pH8.0, 10 мМ NaCl, 0,2% NP-40) с только что добавил ингибиторы протеазы (1:500 разведение) и 0,1 мМ PMSF. Инкубируйте в холодной комнате с вращением в течение 90 минут, центрифуге при 2500 оборотов в минуту в течение 15 минут, и удалить супернатант.
3. Ограничение ферментативного расщепления с Bgl II
- Ресуспендируют ядер в 0,5 мл 1 х NEB буфера 3, и добавить 15 μlof 10% SDS. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа при встряхивании, затем добавить 45 мкл 20% Triton X-100 на секвестр SDS. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа при встряхивании.
- Используйте аликвоту 1 х 10 6 ядер (около 15 мкг, одна десятая часть оригинальной клетки) для ограничения пищеварения фермента. Выньте 55 мкл ядер решение с шага 3.1 и составляют до 500 мкл 433 мкл 1 х NEB буфера 3 и 12 мкл Bgl II (50U/ul). Инкубировать при 37 ° С в течение ночи.
4. Лигирование взаимодействующих сегментов ДНК
- Деактивировать рестрикции путем добавления 95 мкл 10% SDS, и денатурации нагреванием при 65 ° С в течение 20 минут на водяной бане.
- Добавить 7 мл 1 х перевязки буфера (30 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ MgCl 2, 10 мМ DTT, 1 мМ АТФ) и 360 мкл 20% Triton X-100 и инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа .
- Нижняя температура до 16 ° С и добавить 50 мкл 400 ед / мкл T4 ДНК-лигазы. Инкубируйте образца при 16 ° С в течение 4 часов, а затем при комнатной температуре в течение 30 минут.
5. Очистка ДНК
- Добавить 300 мкг протеиназы К, и инкубировать при температуре 65 ° С в течение ночи.
- Добавить 5 мкг РНКазы и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 30 минут
- Purify ДНК фенол / хлороформ добычи, и осадок ДНК в изопропаноле. Растворите ДНК в 150 мкл стерильной дистиллированной водой.
6. Пищеварение с Msp я и перевязки с олигонуклеотидных линкеров
- Инкубируйте 2μg очищенной ДНК с 5 единиц Msp я при 37 ° С в течение 4-6 часов. Деактивировать Msp я при температуре 65 ° С в течение 10 минут, затем осадок ДНК в этаноле с 1 мкл 5 мг / мл гликогена. Растворите гранулы ДНК в 50 мкл стерильной дистиллированной водой.
- Смешать 50 мкл Msp я обработанных ДНК с 2 мкл 20 мкМ компоновщик L олигонуклеотида (5'-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 '), 1 мкл 20 мкМ олигонуклеотида S (5'-cggtgaatc-3'), 1 мкл стерильной дистиллированной воды и 6 мкл 10 х T4 ДНК-лигазы буфера. Обложка смеси с жидким воском.
- Денатурировать олигонуклеотидов при 50 ° С в течение 1 минуты и дайте остыть постепенно до 10 ° С в 0,5 ° С / мин градиент в термоциклер.
- Добавить 1 мкл 400 ед / мкл T4 ДНК-лигазы и инкубировать при 15 ° С в течение ночи. Purify компоновщик-лигируют ДНК с использованием ПЦР Очистка QIAquick комплект, и вымывается в 50 мкл стерильной дистиллированной водой.
7. ПЦР-амплификации и анализа последовательностей
- Выбор грунта для конкретного региона ДНК, которые вы хотите просмотреть на большие расстояния взаимодействия (например, "приманка"). В этом примере мы используем ABL-1.
- Принимать по 1 мкл очищенной ДНК, чтобы выполнить первый раунд ПЦР, используя 1 мкл 20 мкМ ABL -1 специфического праймера # 4656 (5'-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 '), 1 мкл 20 мкМ компоновщик специфического праймера # 2963 (5'- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 '), 3μl 3 х Клен Taq ДНК-полимеразы I коктейль и 3 мкл стерильной дистиллированной водой. Два мкл 32 Р-дЦТФ добавляют 100 мкл 3 х Клен Taq ДНК-полимеразы I коктейля перед ПЦР. Термического цикла на горячий старт ПЦР 72 ° С в течение 2 мин, 95 ° КСОР 2 минуты, 18 циклов 95 ° C в течение 20 секунд, 65 ° C в течение 40 секунд и 72 ° С в течение 1 минуты; последнее продление проводится при температуре 72 ° Cв течение 5 минут.
- Purify первом раунде продуктов ПЦР с использованием ПЦР Очистка QIAquick комплект, и элюции ДНК в 30 мкл стерильной дистиллированной водой.
- Принимать по 1 мкл 100 х разбавленной первым продуктом ПЦР для выполнения второй раунд ПЦР с вложенными праймерами, добавляя 1 мкл 20 мкМ ABL-1 специфического праймера # 4626 (5'-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 ') (рис. 1а), 1 мкл от 20 мкМ компоновщик специфического праймера # 2961 (5'-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 '), 3 мкл 3 х Клен Taq ДНК-полимеразы I коктейль и 3 мкл стерильной дистиллированной водой. Тепловой график велосипеде 25 циклов 95 ° С в течение 20 секунд, 67 ° С в течение 40 секунд и 72 ° С в течение 1 минуты, а затем расширение при 72 ° С в течение 5 минут.
- Визуализация продуктов ПЦР, запустив 5% мочевины-PAGE гель и сканирования подвергается экране в PhosphoImager (рис. 1b). Каждая полоса ПЦР могут быть переработаны из геля путем растворения геля полосы в пробирку Эппендорфа, содержащие 60 мкл стерильной дистиллированной воды, и инкубации при температуре 95 ° С в течение 5 минут. Центрифуга кратко на 10000 оборотов в минуту в течение 10 секунд, чтобы собрать все образцы. Удалить 1 мкл для использования в качестве ДНК-матрицы для выполнения ПЦР с 2961/4626 пары праймеров с использованием тех же условиях, как описано выше. Анализ последовательности могут быть выполнены после очистки с использованием ПЦР Очистка QIAquick комплект.
- Последовательности ДНК анализировали с помощью онлайн-инструмент для определения их хромосомного место на веб-сайте: http://genome.ucsc.edu (рис. 1в). Нажмите на кнопку "блат", чтобы ввести новое окно, которое позволяет вставить последовательность ДНК, новое окно, после нажатия "Отправить", и показывает, "блат Результаты поиска». Нажмите на кнопку "браузер" хит-со 100% идентичности ввести следующее окно, чтобы показать расположение последовательности ДНК.
8. Представитель Результаты
1. ACT методом с использованием ABL-1 регион в качестве приманки, чтобы определить свою долгую взаимодействий ДНК-диапазона
Как показано на рисунке 1а, два Bgl II-сайты и один BamH Я сайта были выбраны для анализа ACT. Во втором раунде ПЦР, грунтовки набор 4626/2961 был использован для усиления ABL-М1, 4630/2961 был использован для ABL-М2 и 4636/2961 был использован для ABL-M3. Типичная картина показывает, гель от одного до нескольких полос (рис. 1b). Каждый фрагмент из анализа ACT состоит из двух комбинированных сегментов ДНК: один сегмент является производным от региона ДНК приманки, а во втором сегменте происходит от ассоциированного участника, который был присоединен к сегменту регионе приманку на первой последовательности ферментов признание ограничений. Вторая последовательность признание фермента появится в конце ассоциированный партнер последовательности (рис. 1в). Клонированных ABL-М1 фрагмент содержит ДНК из области ABL1 находится на хромосоме 9q32.4 от +133,592,306-133,592,399 и ассоциированный партнер находится на хромосоме 3p13 от +71,869,882-71,870,107. Личности связаны партнеры обнаружены взрывные их последовательностей с помощью УСК браузер генома (GRCh7/hg19 выпущен в феврале 2009 года). PROK2 было определено в качестве ассоциированного партнера в chr3p13 локуса.
Кроме того, ABL-M2 ассоциированный партнер был локализован в chr5q21.1, а клон ABL-M3 был идентифицирован как внутри-хромосомных ассоциации возле ABL-1 локуса.
2. Определение реже долго взаимодействия диапазон, используя ACT анализа
Другие анализы, основанные на 3C сообщили многие другие взаимодействующих партнеров, чем у нас показано на рисунке 1 и в Igf2 / H19 локус 12. Методология, что мы наметили выберет наиболее распространенных долго взаимодействия диапазона. Тем не менее, за счет увеличения количества циклов ПЦР можно определить дополнительные, менее частые ассоциации, а также (рис. 2).
3. Различия в длинный ряд взаимодействий в раковых клетках, по сравнению с нормальными тканями.
Анализ ACT также может быть использован для выявления различий в ядерной архитектуры и долго взаимодействия в диапазоне от нормальных клеток и раковых клеток (рис. 3). Эти различия могут отражать изменения ядерной архитектуры, которые происходят во время клеточного трансформации, и таким образом этот анализ в конечном итоге может применяться в диагностических целях. Аналогичные модели геля, которые происходят как в нормальных и раковых тканей показал, что анализ ACT является надежным и повторяемым. Хотя анализ ACT может определить дальний ДНК партнеров, дальнейшего анализа, таких как рыбы и чип анализы, необходимые для проверки наличия выявленных ассоциаций между удаленными локусов. Генетические, физиологические и биохимические исследования могут быть выполнены, чтобы выяснить биологические последствия этих долгих ассоциации ДНК диапазона.
Рисунок 1 ACT методом с использованием ABL-1 регион в качестве приманки ДНК в HL-60 клеток. a. ДНК-структурыЮр в ABL-1 региона. Первый фермент ограничения, используемые в ACT анализа была Bgl II. Праймеров для второго раунда ПЦР также помечены стрелками и соответствующими номерами грунт. b. Гель структуры АСТ тест, в 5% мочевины-PAGE. Грунтовка пары 4626/2961 был использован для усиления клон ABL-М1 в ПЦР, 4630/2961 был использован для клона ABL-М2 и 4636/2961 был использован для клона ABL-M3. c. Последовательность ДНК клона ABL-M1. Фрагмент ДНК из ABL-1 приманку ДНК обозначена красным цветом, а ассоциированный партнер ДНК обозначена в голубой цвет. Bgl II сайт (AGACTC) был назван в зеленый и Msp Я сайта (КСДУ) обозначено фиолетовым цветом.
Рисунок 2 циклов ПЦР повлиять на результаты ACT анализа. Использование регионе импринтинга управления (ICR) в Igf2/H19 локус в качестве приманки ДНК в клетках мыши фибробластов, различных программ велосипедного были применены в первом и втором раундах ПЦР в ACT анализа. 18-20 циклов в первом раунде ПЦР не усиливают сигнал достаточно для визуализации. Двадцать пять циклов во втором результатов ПЦР в ясную полосы, а при увеличении числа циклов для второго раунда ПЦР-индуцированной мазок картины в дополнение к более полос.
Рисунок 3 Обнаружение различий в ядерной архитектуры между нормальной ткани толстой кишки и тканей рака толстой кишки в анализе ACT. A. ДНК-структуры региона ICR на IGF2/H19 локус и IGF2 гена. ДПН II сайтов для анализа ACT помечены. Грунтовки использоваться во втором раунде ПЦР помечены стрелками и цифрами в разные цвета, которые соответствуют каждой полосы в панели б фигуры. b. Гель структуры АСТ тест, в 5% мочевины-PAGE. Нормальные ткани толстой кишки MAD03-1423 и рак толстой кишки ткани MAD04-149 была получена от совместной Сети по вопросам людских тканей (CHTN) Западная дивизии. После каждой толстой ткани гомогенизировали, ACT анализ был выполнен в соответствии с процедурами, описанных здесь. Полоса 1 представляет ПЦР результаты, используя пары праймеров # 2961and # 4161 (5'-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 '), помеченные в розовом в панели; переулок 2 представляет ПЦР результаты, используя пары праймеров # 2961 и # 4163 (5'-gccgcgcggccacttccgattcc-3 ') помечены оранжевым цветом в панели; переулок 3 представляет результаты с помощью ПЦР пары праймеров # 2961 и # 5145 (5'-gccatgcaggtaggatttgagctg-3') помечены синим цветом в панели; переулок 4 представляет результаты с помощью ПЦР пары праймеров # 2961 и № 5151 (5'-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 ') помечены зеленым цветом в панели a. Уникальные группы, которые появляются только в нормальной ткани толстой кишки помечены желтыми стрелками, а те группы, которые появились только в толстой ткани рака помечены красными стрелками. МЦР, импринтинга управления региона; ПМР, различных метилированных регионе.
Discussion
Деккер и соавт. Разработали захвата хромосомы конформации (3C) подход для выявления частоты взаимодействия между двумя геномных локусов 1, и 3C широко используется для исследования внутри-хромосомных и меж-хромосомные ассоциации между двух известных участков ДНК в клетках млекопитающих, 2 -9. Хотя недавно разработанный Привет-C методика может быть применена для изучения генома ДНК ассоциации, ACT анализа все еще эффективный метод для изучения локус-специфической ДНК взаимодействия 10-11. Мы изменили этот подход для идентификации неизвестных участков ДНК, которые связаны с известными ДНК региона в культуре мышиных и человеческих клеток (рис. 1). Мы назвали этот метод связан хромосомы ловушку (ACT) анализа, так как она дает нам надежный и воспроизводимый метод для выявления новых неизвестных партнеров ДНК, которые ассоциируются с известными области ДНК-мишени 12. Успешное 3C анализа с соответствующим контролем проводится перед выполнением новые аспекты анализа ACT 13. Для того, tofind столько связано участков ДНК, как это возможно, необходимо использовать различные комбинации первого и второго ферментов рестрикции. Это особенно важно, ограничивающих использование ферментов, которые нечувствительны к CpG метилирования для выполнения первого шага 3C труб. Связывающий белок и метилирования ДНК также могут влиять на ограничение ферментативного расщепления эффективность и может привести к выходу из строя перевязки связанных областей ДНК для определенных пищеварения ферментов рестрикции. Возникновение внутри или между хромосомными перевязки зависит от белок-ДНК сшивания и соответствующие физические карты оба связаны регионах ДНК. Таким образом, некоторые предварительные эксперименты имеют важное значение для создания практически эффективная концентрация формальдегида и сроки лечения в ACT анализа. Диапазон конечных концентраций формальдегида (from1.5% до 2%) были использованы в нескольких лабораториях в течение 3C часть анализа 7,9. Кроме того, олигонуклеотиды, используются в качестве линкеров может быть создан, чтобы соответствовать сплоченного снижены на конец второго фермента ограничений. Хотя мы обнаружили, что 18-20 циклов в первом раунде ПЦР и 20-25 циклов во втором раунде ПЦР могут обеспечить четкие полосы, необходимо создать лучший ПЦР условия для каждого эксперимента (рис. 2). Intra-молекула отжига между 5'-конце и 3'-конце комплементарную последовательность адаптер ДНК может происходить в ПЦР, он ингибирует адаптер-специфического праймера отжига с молекулой ДНК, в результате которой значительно ниже, усиления эффективности в первые несколько циклов. После ДНК-мишени был усилен для циклов, его сумма может быть значительно больше, чем эти неспецифические реакции, и может способствовать конкуренции грунтовки отжига с молекулами ДНК-мишени. По этой же причине мы можем увидеть фоне усиления, и почему первый раунд ПЦР-продукт должен быть разбавлен до уменьшения фонового amplification.It важно, чтобы удалить излишки грунтовки от реакции ПЦР с целью уменьшения фона во второй раунд ПЦР. Как и во всех ПЦР-эксперименты, очень важно, чтобы дизайн праймеров, которые не находятся в повторяющейся последовательностью регионов, которые составляют большую часть человека и мыши ДНК. Хотя недавно разработанный Привет-C методика может быть применена для изучения генома ДНК ассоциации, ACT анализа все еще эффективный метод для изучения локус-специфической ДНК взаимодействия.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Adelle Murell и Вольф Райк очень много для обмена их 3C протокола. Эта работа была поддержана Министерством обороны и исследовательской службы Департамента по делам ветеранов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | |
| acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | |
| ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | |
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | |
| RNase A | Invitrogen | 12091-039 | |
| SDS | Invitrogen | 15525-017 | |
| urea | Invitrogen | 15505-035 | |
| BamH I | New England Biolabs | R0136T | |
| Bgl II | New England Biolabs | R0144M | |
| Dpn II | New England Biolabs | R0543T | |
| Msp I | New England Biolabs | R0106S | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
| proteinase K | New England Biolabs | P8102S | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | |
| proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Nonidet P-40 | Roche Group | 11754599001 | |
| KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | |
| dCTP alpha P32 | PerkinElmer, Inc. | BLU513H250UC | |
| PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | |
| Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | |
| OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |
References
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing chromosome conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
- Apostolou, E., Thanos, D. Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression. Cell. 134, 85-96 (2008).
- Duan, Z. A three-dimensional model of the yeast genome. Nature. 465, 363-367 (2010).
- Lomvardas, S. Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell. 126, 403-413 (2006).
- Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops. Nat Genet. 36, 889-893 (2004).
- Schoenfelder, S. Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells. Nat Genet. 42, 53-61 (2010).
- Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature. 435, 637-645 (2005).
- Vakoc, C. R. Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1. Mol Cell. 17, 453-462 (2005).
- Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation. Science. 311, 1149-1152 (2006).
- Lieberman-Aiden, E. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
- Berkum, N. L. van Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes. J Vis Exp. , (2010).
- Ling, J. Q. CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1. Science. 312, 269-272 (2006).
- Dekker, J. The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls. Nat Methods. 3, 17-21 (2006).
