Summary
Descriviamo un metodo minimamente invasivo e indolore per misurare la forza muscolare degli arti posteriori del cane e la risposta muscolare alle ripetute contrazioni eccentriche.
Abstract
Descriviamo un metodo minimamente invasivo e riproducibili per misurare la forza dei muscoli pelvici canina degli arti e la risposta muscolare alle ripetute contrazioni eccentriche. L'arto pelvico di un cane anestetizzato è immobilizzato in una cornice stereotassica per allineare la tibia ad angolo retto rispetto al femore. Adesivo avvolgere appone la zampa di un pedale montati sull'albero di un servomotore per misurare la coppia. Stimolazione nervosa percutanea attiva i muscoli degli arti pelvici della zampa a uno push (estendere) o tirare (flex) contro il pedale per generare una coppia isometrica. Stimolazione del nervo tibiale percutanea attiva i muscoli estensori tibio-tarsica. Ripetute eccentrico (allungamento) contrazioni sono indotte nei muscoli flessori tibio-tarsica con la stimolazione del nervo peroneo percutanea. Il protocollo eccentrico è costituito da una contrazione isometrica iniziale seguito da un tratto forzata imposta dal servomotore. La rotazione si allunga in modo efficace, mentre il muscolo si contrae, ad esempio, una contrazione eccentrica. Durante la stimolazione dei muscoli flessori sono sottoposte a un isometrica 800 msec e 200 msec contrazione eccentrica. Questa procedura viene ripetuta ogni 5 sec. Per evitare l'affaticamento, 4 min resto segue le contrazioni ogni 10 con un totale di 30 contrazioni eseguite.
Protocol
1. Impostazione per l'esperimento
- Caricare il Controllo dinamico muscolare (DMC) del software.
- Accendere le istruzioni del produttore rig fisiologia successivo.
- Esegue il software DMC:
Si presume che l'hardware è collegato al computer che esegue il software di DMC, e che il sistema è calibrato. Il software può essere modificato di volta in volta, quindi, le istruzioni sono fornite di seguito riguardano la versione attuale del software che usiamo. Quando il software è aperto, è già in esecuzione.
L'utente può inizialmente scrivere un protocollo in DMC (ad esempio, per stimolare a 50 Hz per 1,5 s per produrre un tetano isometrico) e il protocollo possono essere salvati per un successivo utilizzo. Usiamo due protocolli standard: (1) protocollo contrazione isometrica (per esempio, contrazione o tetano) e (2) eccentrico stiro-infortunio protocollo. Si comincia con il protocollo di contrazione isometrica per la contrazione. Per ottimizzare la contrazione, lo schermo uscite monitor viene utilizzato; coppia generata durante la contrazione si può osservare come gli elettrodi vengono spostati. Quando la risposta contrazione massima è raggiunta, i dati sono raccolti con il ritorno alla schermata principale (selezionare Continua) e selezionando Begin e Fatto. I file vengono salvati dal Salva con nome finestra pop-up. Con gli elettrodi mantenuto nella stessa posizione, un tetano (50 Hz) viene poi raccolto e salvato. Quando tutte le contrazioni isometriche sono stati completati, l'eccentrico stiro-infortunio protocollo può essere caricato ed eseguito. Perché ci sono una serie di contrazioni che deve essere eseguito in questo protocollo (10 contrazioni), nella schermata principale il tasto One Run è selezionato a rivelare lo stato Esegui tutti. Ora, quando Begin è selezionata, un Run Tutti i protocolli finestra pop-up sembra che chiede il nome del file radice e la directory in cui i file devono essere salvati. Poi, inizio prove della serie Fatto protocollo e vengono selezionati per iniziare il protocollo eccentrico. I file vengono salvati automaticamente nella directory selezionata.
2. Il posizionamento degli animali nei rig fisiologia
- La cura degli animali e l'utilizzo del comitato (ACUC) le linee guida devono essere seguite per tutte le procedure che coinvolgono gli animali.
- Anestetizzare cane in anestesia inalatoria (come isoflurano) secondo il protocollo approvato. Controllare batter riflesso per essere sicuri che l'animale è profondamente anestetizzati. CO 2 monitoraggio, pulsossimetria e la temperatura devono essere attentamente monitorati durante l'intera procedura. Usiamo tipicamente propofol per l'induzione seguita da sevoflurano per l'anestesia inalatoria.
- Radersi i capelli intorno al laterale ginocchio (ginocchio), dove gli elettrodi stimolanti sarà posta (ad esempio, l'aspetto laterale di inizio degli arti, alla testa del perone a 2-3 cm distalmente al grande trocantere.
- Cane posizione sul tavolo fisiologia in decubito dorsale con l'arto pelvico posizionato in modo che il femore e della tibia fare un angolo retto, e la tibia è parallelo al piano del tavolo. In entrambi i casi l'arto destro o sinistro può essere verificata.
- Prima di collegare zampa di cane sforzo al pedale, controllare per assicurarsi che il pedale forza è chiara e sicura a girare. Seguire la procedura di accensione per il rig fisiologia e attivare il pedale. Nota: il pedale forza dovrebbe essere "duro" quando l'utente tenta di spostarlo manualmente.
- Delicatamente resto zampa del cane nel pedale, misurare e registrare la lunghezza della zampa del cane dall'asse centro di rotazione fino alla fine della cifra laterale.
- Fissare la zampa del pedale con elastici auto-aderente a capo.
3. Contrazione isometrica di coppia (flessione tibio-tarsica)
- A seguito di un controllo di sicurezza, collegare sterile monopolare schermato 24-gauge elettrodi stimolante per l'unità di isolamento stimolo (SIU).
- Impostare lo stimolatore di: uscita a impulsi continui a 1 Hz (1 impulso al secondo)
- Impostazioni del software: Caricare il protocollo di contrazione isometrica (il principale protocollo di carico schermata di selezione). Il pulsante di una corsa dovrebbe essere visibile accanto al pulsante Inizia. In questo modo il protocollo è eseguito solo una volta.
- Con le mani guantate, pulire la pelle con l'alcol, e palpare il nervo peroneale comune solo distale del perone prossimale laterale. Con un dito che segna l'area del nervo, inserire con cautela la (nera) elettrodo catodo sotto la pelle e solo esterni al periostio. L'elettrodo deve essere collocata parallelamente alla superficie della pelle ad una profondità di circa 2 cm, sufficiente a prevenire l'elettrodo di muoversi quando la mano viene rimosso.
- Posizionare la (rosso) elettrodo anodico sotto il parallelo pelle, e leggermente distale dell'elettrodo catodico. Entrambi gli elettrodi dovrebbe essere interno al nervo peroneale comune appena distalmente alla testa del perone.
- Attivare la stimolazionetore a 1 Hz. Osservare le risposte contrazione sul monitor. Fare piccoli aggiustamenti nelle posizioni degli elettrodi per ottenere l'ampiezza maggiore contrazione possibile. L'elettrodo dovrebbe essere completamente rimosso e sostituito in tre o quattro incrementi di ½ centimetro parallela alla tibia per trovare la risposta più grande contrazione. Questo è un componente fondamentale della procedura e grande cura deve essere presa per trovare la risposta più grande.
- Registrare le risposte contrazione uscendo dalla schermata di uscite monitor (selezionare Continua), poi selezionare Inizio e Fine per raccogliere i dati. Salvare il file con il nome del file desiderato in Salva con nome finestra pop up. Spegnere lo stimolatore.
4. Isometrica tetanica coppia (flessione tibio-tarsica)
- Senza spostare gli elettrodi, modificare le impostazioni stimolatore a 50 Hz per 1,5 sec e abilitare la funzione esterna grilletto. Questo permette lo stimolatore per essere attivato dal software.
- Impostazioni del software: Lo stesso protocollo contrazione isometrica viene utilizzato per raccogliere la risposta tetanica come per la contrazione. Supponendo che gli elettrodi stimolanti non sono stati spostati, Inizio e Fine sono selezionati per produrre il tetano. Nel protocollo isometrica per produrre un tetano, lo stimolatore viene attivato dal software per mantenere i tempi corretti. Salva la risposta tetanica in Salva con nome finestra pop up.
5. Protocollo eccentrico
- Senza spostare gli elettrodi, modificare le impostazioni stimolatore di: 50 Hz per 1 sec (100V) e attivare la funzione esterna grilletto. Questo permette lo stimolatore per essere attivato dal software.
- Impostazioni del software: il carico eccentrico protocollo lesioni tratto, un comando al servomotore per ruotare 29 gradi (30 gradi è il massimo). Selezionare Esegui tutti. Selezionare Inizio; inserire il nome del file di root per la serie eccentrico di file e la cartella in cui devono essere salvati. Selezionare Start prove della serie Protocollo, quindi Fine per avviare il protocollo.
- In questo protocollo lo stimolatore è impostato per essere attivato dal software per mantenere i tempi corretti. Come risposta ad ogni contrazione eccentrica appare sullo schermo, questo viene automaticamente salvato.
- Un periodo di riposo quattro minuti segue ogni serie di dieci contrazioni eccentriche.
- Raccogliere un totale di 30 contrazioni eccentriche (tre serie di dieci contrazioni; ogni set separati da un periodo di riposo quattro minuti).
6. Contrazione isometrica di coppia (estensione tibio-tarsica)
- Ripetere il protocollo di contrazione di cui sopra, ma gli elettrodi perpendicolari alla pelle e prossimale al posizionamento degli elettrodi originale per il protocollo di flessione. Il nervo tibiale viene stimolato in quanto i corsi caudalmente e distalmente nel ventre del muscolo gastrocnemio. Accoppiato stimolante ed elettrodi di riferimento vengono inseriti nel profondo la muscolatura caudale e solo in prossimità del ginocchio. Il punto approssimativo di posizionamento è lungo una linea che divide in due l'angolo 90 ° formato dal ginocchio (ginocchio). Poiché il nervo tibiale è più profondo (e caudale) al nervo peroneo comune, gli elettrodi devono essere posti in diverse aree per suscitare le potenzialità contrazione ottimale. Questo è un componente fondamentale della procedura. Nota: tracciati di coppia per la contrazione tibio-tarsica e tetania appare invertita rispetto a tracciati flessione tibio-tarsica.
7. Isometrica tetanica coppia (estensione tibio-tarsica)
- Senza spostare gli elettrodi, modificare le impostazioni stimolatore a 50 Hz per 1,5 sec e abilitare la funzione esterna grilletto. Questo permette lo stimolatore per essere attivato dal software.
- Impostazioni software: 50 Hz per 1.5 sec e abilitare la funzione esterna grilletto. Questo permette lo stimolatore per essere attivato dal software.
- Impostazioni del software: Lo stesso protocollo contrazione isometrica viene utilizzato per il tetano che per la contrazione. Supponendo che gli elettrodi stimolanti non sono stati spostati, Inizio e Fine sono selezionati per produrre il tetano.
- Nel protocollo isometrica per produrre un tetano, lo stimolatore viene attivato dal software per mantenere i tempi corretti. Salva la risposta tetanica nel pop up finestra Salva file.
8. Analisi dei dati
- Analisi dinamica muscolare (DMA) programma (Aurora scientifico) è usato per ottenere la coppia e le informazioni raccolte dalla contrazione temporale, contrazioni tetaniche ed eccentrico.
- L'esecuzione del programma DMA: Il software può essere modificato di volta in volta, quindi, le istruzioni sono fornite di seguito riguardano la versione attuale del software che usiamo. Quando il software DMA è aperto non è in esecuzione. Per attivare il programma, selezionare il pulsante freccia bianca in alto a sinistra. Il software DMA ha un certo numero di funzioni, ma per il nostro scopos, solo alcune funzioni pertinenti saranno descritte.
Caricare un file da analizzare: Il file di Ricarica recenti dati o file di dati nuovi finestra pop-up appare quando il programma viene avviato DMA. Selezionare Nuovo, nella finestra successiva selezionare Labview, nella finestra successiva, seleziona la cartella appropriata e file, selezionare Apri. Selezionare Rimuovi Plot filtro per eliminare questa finestra. Inserire una frequenza del filtro nel taglio casella Frequenza. Frequenza del filtro ottimale dovrebbe essere determinata sulla base dei dati specifici da valutare. Come esempio, si usa 30 Hz per le nostre risposte isometrica e 10 Hz per le risposte eccentrico. Selezionate il pulsante Usa i dati filtrati. In Dati Plot Select, selezionare Forza filtrata. Utilizzare le due barre di scorrimento in basso per espandere la visualizzazione e spostarsi attraverso il file. - Twitch analisi (Fig. 1): Assumendo che il file viene caricato ed i passaggi precedenti sono stati completati, impostare la posizione dei cursori: Ci sono 3 cursori: (1) blu (2), giallo e (3) bianco. Per le contrazioni isometriche e tetani o altri contrazioni isometriche, il blu è impostata nel punto in cui sorge coppia dalla coppia di riposo, il giallo è posto dove la coppia torna a coppia a riposo (cioè, dopo la fase di rilassamento), il bianco è posto a alla destra del cursore giallo (non necessario). I cursori possono essere facilmente spostati con premuto il tasto sinistro del mouse e trascinando il cursore selezionato nella posizione desiderata.
Eseguire l'analisi: quando i cursori sono posizionati, selezionare fare analisi muscolare, poi mostrare i risultati. Sul analizzato i dati muscolare Risultati finestra pop-up, una serie di variabili vengono visualizzati come Forza massima, Forza di base; ½ Relax Time, ecc I dati sono presentati per la risposta della coppia che si trova tra i cursori 1 (blu) e 2 (giallo ). Tutte queste variabili o variabili specifiche possono essere registrati in un file di dati, tuttavia, questo processo non è qui descritto. Se un registro di dati non è impostato, i dati dovrebbero essere registrati a mano. Selezionare Chiudi finestra per tornare alla schermata principale. Selezionare Programma Esci per chiudere il DMA, quindi selezionare la freccia bianca per iniziare l'analisi di un nuovo file. - Tetania analisi (Fig. 2): La stessa procedura descritta sopra per la contrazione.
- Analisi eccentrico (Fig. 3): L'analisi eccentrico richiede più passaggi per impostare e usa tutti e 3 i cursori. Se la risposta è negativa della coppia eccentrica (cioè, i tracciati appaiono coppia nella direzione verso il basso), può essere invertita inserendo -1 nella zona di riferimento (cmq) box (valori di coppia sono invariati) e selezionare Non normalizzare, il pulsante inverte per indicare i dati sono stati normalizzati (in questo caso, invertiti). Inserire la frequenza di taglio desiderata (es. 10 Hz) e selezionare Usa dati non filtrati per invertire il pulsante per utilizzare i dati filtrati, ora dati filtrati verranno utilizzati per l'analisi. Posizionare il cursore blu nel punto in cui una coppia isometrica comincia a salire da una coppia di riposo, posizionare il cursore giallo nel punto in cui la coppia eccentrica tratto comincia a salire dal pianoro isometrica (vedi figura sotto), posizionare il cursore bianco al quale la coppia torna a riposo coppia. Seleziona Do Analisi muscolare, poi mostrare i risultati. Sui risultati del muscolo analizzato i dati finestra pop-up, è possibile selezionare i dati tra i cursori 1 (blu) e 2 (giallo) per i dati di coppia isometrica, o tra i cursori 2 (giallo) e 3 (bianco) per i dati di coppia eccentrica. Tutte queste variabili o variabili specifiche possono essere registrati in un file di dati, tuttavia, questo processo non è qui descritto. Se un registro di dati non è impostato, i dati dovrebbero essere registrati a mano. Selezionare Chiudi finestra per tornare alla schermata principale. Selezionare Programma Esci per chiudere il DMA, quindi selezionare la freccia bianca per iniziare l'analisi di un nuovo file.
9. Rappresentante Risultati
- Twitch di coppia: la stimolazione del nervo tibiale (1 Hz) attivato contrazioni dei muscoli estensori singolo tibio-tarsica (Fig. 1). Si noti che l'asse Y indica "forza", della coppia (il prodotto della forza e della distanza) è calcolata da parte dell'utente. Misuriamo la lunghezza della zampa (rispetto all'asse di rotazione fino alla fine della cifra laterale). Questa lunghezza è la distanza (braccio di leva) utilizzato per determinare la coppia (Nm).
- Isometrica coppia tetanica (estensione tibio-tarsica): la stimolazione del nervo tibiale tetanized tibiotarsica muscoli estensori (1,5 sec treno di impulsi di 50Hz). Abbiamo usato il software di controllo dinamico del muscolo computer (DMC, Aurora Scientific, Inc.) per controllare tempi stimoli e di catturare le risposte di coppia (Fig. 2).
- Protocollo eccentrici: le contrazioni eccentriche sono stati condotti nel flessori tibio-tarsica. Percutanea del nervo peroneale Stimulzione attivata una contrazione isometrica iniziale seguita da rotazione congiunta causando l'allungamento dei muscoli flessori attivato (contrazione eccentrica; Fig. 3) 6.
Figura 1. Posizionamento di punto in bianco (# 1), giallo (# 2) e bianco (# 3) cursori per analizzare una contrazione. Una schermata rappresentante del software DMA viene mostrato per contrazione estensione tibio-tarsica in un cane sano 13 kg. Si noti che per la successiva analisi effettuata dal software, i dati vengono esportati in un foglio di calcolo, e l'uscita forza (mostrato in figura come Forza (g) possono essere convertiti in coppia (Nm). Coppia è calcolata dal prodotto della forza e braccio di leva distanza (in questo la distanza = lunghezza misurata dall'asse di rotazione a cifre laterale della zampa).
Figura 2. Posizionamento di punto in bianco (# 1), giallo (# 2) e bianco (# 3) cursori per analizzare un tetano. Uno schermo rappresentante colpo del software DMA viene mostrato per tibiotarsica tetania estensione, stesso animale come mostrato in Fig. 1.
Figura 3. Posizionamento di punto in bianco (# 1), giallo (# 2) e bianco (# 3) cursori per analizzare un eccentrico stiro-infortunio contrazione. Una schermata rappresentante del software DMA è indicato per un singolo tratto eccentrico-infortunio contrazione in un ambiente sano cane di 13 kg. L'altopiano iniziale (linea verde) illustra la fase isometrica della contrazione. La fase isometrica è seguita da un eccentrico (allungamento) di fase, come illustrato dal picco rapido la linea verde. Ripetute contrazioni eccentriche tipicamente provocare un calo costante della coppia isometrica.
Discussion
Questo protocollo è utilizzato per valutare la funzionalità muscolare grandi animali in vivo per analizzare, documentare e determinare l'efficacia degli interventi di trattamento o di documentare le caratteristiche biologiche della progressione della malattia. 1-6 posizionamento degli animali, il posizionamento degli arti e il posizionamento di elettrodi sono le variabili chiave che in modo significativo i risultati impatto. In uno studio preliminare, la media concentrazione alveolare (MAC) valori per isoflurano non ha influenzato significativamente misure di forza (RO Schueler, Koch H, Kornegay JN, dati non pubblicati, 1993). Hardware e software sono disponibili in commercio e metodi ben stabiliti. 7, 1,2,8,4,9-11,6,12 Si raccomanda agli utenti di ottenere e utilizzare il software e le attrezzature di cui sopra quando si segue questo protocollo.
Modifiche: i limiti del servomotore attuali comprendono la massa corporea di circa 23 kg e lunghezza zampa di 20 cm. Si noti che il limite di coppia è ~ 8 N-tester per il trasduttore di coppia (modello 310LR) descritto qui. Questo valore può essere superato da cani normali a 6 mesi o più. Eventuali modifiche al protocollo correnti includono l'aggiornamento del software e per aumentare la gamma di coppia del trasduttore. Aurora scientifico produce un dispositivo di posizionamento degli arti per gli animali di grandi dimensioni che possono essere sostituiti per il frame stereotassico utilizzati nel protocollo corrente. Questo metodo è stato applicato con successo per altri modelli animali, tra cui i primati non umani.
Disclosures
La produzione di questo video-articolo è stato sponsorizzato da Aurora Scientific, Inc.
Acknowledgments
National Institutes of Health (NIH), Joshua Frase Fondazione, la Distrofia Muscolare Association (MDA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stimulating electrodes | Teca | 25mmx26G | Disposable sterile monopolar needle electrodes |
| Stimulator | Grass Technologies | S88X | |
| Stimulus isolation unit | Grass Technologies | SIU-C | |
| Muscle lever system | Aurora Scientific | 310C-LR | Footplate option |
| Signal interface | Aurora Scientific | Series 604A | |
| Dynamic Muscle Control & Analysis Software | Aurora Scientific | Aurora Scientific | |
| PC/Monitor | Aurora Scientific | Windows XP computer | |
| Limb position device | Aurora Scientific | NA | Can be substituted for stereotactic frame |
| Table | Northstar Customs, LLC | NA | Custom made table |
| Flexible wrap for paw attachment to pedal | Andover | PetFlex(5cmx2m) | May be reused a time or two |
References
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