הדגמת שימושים של ספקטרומטר הכבידה רומן כוח כדי למתוח מדוד חלבונים סיביים

Summary

זהו צעד אחר צעד מדריך המציג את המטרה, תפעול, והתוצאות נציג ספקטרומטר כוח הכבידה הרומן.

Abstract

המחקר של מבנה macromolecular הפך קריטי הבהרה של המנגנונים המולקולריים ותפקוד. יש bioinstruments מוגבל, אבל חשוב כמה מסוגל לבחון את התלות של תכונות כוח חלבונים מבניים. סולם כבר פרמטר הגבלת כיצד במדויק החוקרים יכולים להציץ לתוך העולם nanomechanical של מולקולות, כגון חומצות, אנזימים גרעין, חלבונים מנוע המבצעים של חיים עבודה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא מכוון היטב כדי לקבוע מבנים יליד חלבונים סיביים עם רזולוציה מרחק שוה עם מיקרוסקופ אלקטרונים. עם זאת, מחקרים AFM כוח, הכוחות הם בדרך כלל הרבה יותר גבוה מאשר מולקולה בודדת עשוי להיתקל ^{1, 2.} מלכודות אופטי (OT) טובים מאוד לקבוע את המרחק היחסי בין חרוזים לכודים והם יכולים להקנות כוחות קטנים מאוד ^3. עם זאת, הם אינם אורכים תשואה אבסולוטית מדויק של מולקולות הנחקרת. סימולציות מולקולרית לספק מידע תומכת ניסויים כאלה, אבל הם מוגבלים ביכולת להתמודד עם גדלים באותו מולקולרי גדול, מסגרות זמן רב, לשכנע כמה חוקרים בהעדר ראיות תומכות אחרות ^{2, 4.}

ספקטרומטר כוח הכבידה (GFS) ממלא נישה קריטי בארסנל של חוקר על ידי מתן שילוב ייחודי של יכולות. מכשיר זה היא מסוגלת לייצר כוחות בדרך כלל עם 98% או יותר דיוק מטווח femtonewton לטווח nanonewton. מדידות מרחק כיום מסוגלים לפתור את אורך מולקולרית מוחלטת עד חמישה ננומטרים, ויחסי חרוז ההפרדה זוג מרחקים עם דיוק דומה מלכודת אופטי. כמו כן, GFS יכול לקבוע מתיחה או ומתעקל שבו הכוח נמצא ליד שיווי משקל, או לספק כוח מדורגים הצבתם נגד שינויים מבניים נמדד. אפשר אפילו לקבוע כמה שאריות חומצת אמינו מעורבים ומתעקל אירועים תחת עומסים כוח פיזיולוגי ^2. בניגוד לשיטות אחרות שבהם יש כוח רב כי כיול חייבת להקדים כל assay, GFS לא דורש כיול כוח כזה ^5. על ידי המשלימה את החוזק של שיטות אחרות, GFS יהיה לגשר על פערים בהבנת Nanomechanics של חלבונים חיוניים מקרומולקולות אחרים.

Protocol

מבוא GFS רומן תצורת

GFS מורכב מרכיבים חיוניים מספר: מיקרוסקופ אור רגיל, הר קו המשווה, מצלמה, מחשב [תמונה 1]. החדר אטום תזרים תאים המחזיקה המדגם היא הכרחית גם על פי תכנון GFS. מיקרוסקופ אור הוא רכוב על גבי ההר קו המשווה ולכן היקף ניתן לסובב את נטיות שונות בחלל. יכולת זו מאפשרת וקטור סטטי הכובד להיות מנוצלים כך דגימות יכול להיות מונחה באופן דינמי ביחס וקטור כך כוח הכבידה יכול להקנות piconewton לטווח המון כוח כדי דגימות. המצלמה מחליפה עדשת עינית המיקרוסקופ של אור, כך שהוא יכול להקליט שינויים בכיוון של המדגם. נתונים אלו גלם דיגיטציה מניפולציות על ידי המחשב כדי לפרש את הנתונים לתוקף בפועל מדידות מרחק. חתום זרימה קאמרית נועד לאפשר את כל דרגות חופש במרחב ללא הפסד המדגם. בתא שוכן המולקולה מדגם אשר קשור סמוך למסוף אחד "מעוגן" חרוז כי הוא מודבק על פני השטח של החדר. הסופית ההפך הוא קשור "ניידים" חרוז כי הוא חופשי מפני השטח של התא. זהו זה חרוז ניידים, ללא תשלום למאגר assay שניתן מופעל עליהם כוח הכבידה ובכך מתיחת מולקולה קשור בשעה כזאת המון כוח נמוך [איור 2]. המדגם פשוט נראה כמו זוג microspheres מתחת למיקרוסקופ, למרות שזה לוקח קצת ניסיון להבחין זוגות שמיש טוב יחד על ידי התקשרות שלהם מולקולה של זוגות שבהם שני חרוזים יושבים על פני השטח של התא זרימה. אחת שינוי במערכת הוא תוספת של פלטפורמה צף המחזיקה GFS והוא הושעה על ידי קפיצים. בתצורה זו, פעם המדגם כבר מסובב למצב שבו כוח הכבידה יכול לפעול על המדגם, הפלטפורמה ואת כל מרכיביו יכול להיות ירד נגד באביב קבוע. ליד בנפילה חופשית, הכוח הפועל על החרוז הנייד הוא קרוב לאפס ועל הרחבה מקסימלית של מעיינות, כוח הכבידה מוכפל ככל פעמיים. בדרך זו, בתגובה מדורגים כוח / מרחק בגרף ניתן למדוד את התנהגות של מולקולה יחידה על המון כוח שונים.

1. Microsphere הכנה

1. הצף על 10 מ"ג של חרוזי זכוכית או סיליקה ב% 0.04-3 Aminopropyltriethoxysilane (לחתוך עם אצטון) במשך שתי דקות.
2. לשטוף עם שני שינויים של מים מזוקקים כפול צנטריפוגות כדי גלולה XG ב 2000 במשך 5 דקות. בטל supernatant.
3. הוסף 5 מ"ל של חיץ צימוד (0.01 מ 'פירידין לחתוך עם מים מזוקקים כפול כדי להתאים את pH 6.0), ולנער את התערובת במרץ. צנטריפוגה כמתואר לעיל. חזור על שלב זה שלוש פעמים.
4. כדי עוגה הרטוב של חרוזים, להוסיף 2 מ"ל של תמיסת gluteraldehyde 5% (חתך חיץ gluteraldehyde עם צימוד). Shake במרץ.
5. מתחת למכסה המנוע, לסובב תערובת / gluteraldehyde חרוז במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר.
6. כמו צנטריפוגה מעל לשאוב supernatant.
7. לשטוף את החרוזים 5 מ"ל של חיץ צימוד על ידי רועדת להם במרץ הצנטריפוגות ואת לשאוב supernatant. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות.
8. הוסף על 15 μL של הנוגדן הרצוי חרוזים לנער במרץ. חרוזים צריך להיות מסובב על 16-24 שעות.
9. מתחת למכסה המנוע, להוסיף 5 מ"ל של תמיסת גליצין מרווה 1 M (לחתוך גליצין עם מים מזוקקים כפול כדי להתאים את pH 7.0). לנער את התערובת במרץ לסובב במשך 30 דקות.
10. צנטריפוגה ואת לשאוב supernatant.
11. הוסף 5 מ"ל של חיץ לשטוף (0.01 מ 'טריס, pH 7.0, אזיד הנתרן 0.1%, 0.1% BSA: 0.15 M NaCl, ו 0.001 M EDTA). Shake זה במרץ, צנטריפוגה ואת לשאוב supernatant. חזור על פעולה זו שלוש פעמים נוספות.
12. שנה חיץ למאגר דלת מלח (0.1 מ 'KCl, 0.02 מ' imidazole: 5 מ"מ MgCl _2; להסתגל pH 7.0). חזור שלוש פעמים.

2. לדוגמה מצורף microspheres

1. קחו כמות קטנה של חרוזים מוכן (כ -2 מ μL עוגה כל החרוזים עם זאת, אם קיים פער גדול בקוטר בין קבוצות, זה יתרון לשימוש סביב יחס של 8:01 גדולים חרוזים קטנים) ולהוסיף אותם צינור microcentrifuge עם חיץ assay. מנמיכים את הריכוז של חלבון שלך סביב 5 מיקרומטר, באמצעות חיץ assay. הכן לפחות בנפח כולל של 400 μL כולל למאגר, החלבון, ועל חרוזים.
2. סובב את התערובת בסל"ד סביב 1 במשך 3 שעות (אם החלבון הוא נסער יותר מדי, זה יהיה המצרפי להיות חסר תועלת).

3. לשכת שקופיות הכנה

1. מעיל עבה שקופיות מיקרוסקופ עם nitrocellulose 0.01% (ב אצטט amyl). בואו להחליק זה יבש למשך כ -10 דקות.
2. עם חותך זכוכית חדה, לחתוך לכסות שקופיות כדי ליצור תא. זה דורש ארבעה רצועות של זכוכית.
3. השתמש למעשהקצה של אורי הזכוכית לגרוף אותו על פני מריחת שומן ואקום משני צידי הגבול.
4. רצועות לחצו שומן מצופה על nitrocellulose יבשים מכוסה שקופית כדי ליצור קופסה על פני השקופית.
5. פיפטה כ - 2 μL של תערובת חרוז / חלבון pipetter ידי הקשה על משטח זכוכית בתוך הקופסה.
6. הוסף על μL 20-400 של חיץ מלח נמוכה, תלוי כמה גדול תא הוא.
7. לחץ תלוש לכסות על גבי הקופסה אשר מצופה כבר עם גריז ואקום כדי לסיים את תא אטום שנאגרו.
8. בואו להחליק לשבת על מקום ברמה כל כך חרוזים יש מספיק זמן כדי לעגן את עצמם nitrocellulose.

4. GFS Data Acquisition

1. הר להחליק על GFS הבמה
2. מה צג המצלמה GFS היא הקלטה לחפש לגיטימי "זוגות חרוז", שבו microsphere קטן מחוברת ליד קו המשווה של microsphere הגדול.
3. כאשר זוג חרוז הפוטנציאל נמצא, לעבור את עומק המיקוד כדי לקבוע אם "ניידים" חרוז לא נח על פני השקופית.
4. פעם זוג מתאים מזוהה, שים לב לזווית ניידים חרוז הוא רחוק ד _{מקסימום} (ד _max = המרחק המקסימלי בין centroids של microspheres יחד). הזז את היקף למצב לרכוש וידאו.
5. הזווית של נסיעה של GFS אמור להיות מספיק כדי להקליט ד _{דק ', מקסימום} ד, ו - ד _דק שעשוי לקרוא 25-90 מעלות בהתאם לאורך של המולקולה.
6. שיא כמו זוג נוסע מ ד ד _דקות עד _{מקסימום} וחזרה d _דקות.
7. זה רעיון טוב גם לצלם סרט של הרקע, כך שהוא יכול להיות מופחתים מאוחר יותר לניתוח.
8. אם ביצוע ירידה GFS, להעביר את היקף בחזרה d _max ולהקליט את הירידה ב לפחות 60 מסגרות לשנייה. החלק הקריטי הוא תנודה הראשון, אבל הרשומה פעמים ארוך יכול לשמש גם למטרות מחקר דינמי.

5. GFS ניתוח נתונים

1. המרה וידאו גלם לתוך תמונה דיגיטלית "thresholded" ולהפעיל מאקרו imageJ כדי לקבוע את המיקום centroid של כל חרוז כל מסגרת של וידאו. זהו גם עבור וידאו הירידה.
2. דאמפ X, Y ו נתונים מן השטח ImageJ לתוך Excel ו העלילה נקודות.
3. אם זוג חרוז הולם נרכשה על ידי וידאו, גבנון בולט בגרף מעיד על החרוזים להיות בשעה הקרובה שלהם (ד _{דק ')} ואת בשיא של הגרף הוא המיקום של ד _{מקסימום.}
4. בעזרת נתונים אלה, ברדיוס של כל חרוז צריך להיקבע דווקא ImageJ וכל מידע זה מוכנס לתוך המשוואה מקוננות:
   D = [(ז חטא α) + ² (g cos α + D _max - ז) ^{2] 0.5}
   g = [ד _דק ² + r ² _ב - (r + r _b) ^{2] 0.5} = r _b חטא β
   c = d _max - r - g
   (D = המרחק בין centroids; g = כוח הכבידה; α = זווית במעלות במקביל העדשה אובייקטיבי; r _b = רדיוס ניידים חרוז; r = רדיוס מעוגן חרוז; הזווית β = ההתקשרות את ציר קו המשווה של חרוז מעוגן.
5. באמצעות רדיוס מצויד של חרוז ניידים אשר גם התשואות נפחו, ולאור צפיפות של חרוז, הכוח חרוז ניידים מקנה על המולקולה ניתן לחשב ב piconewtons לאחר הציפה של ממס מופחת. שיטה זו מודדת את כוח על המולקולה קשור ב piconewtons ומחשבת את אורך המולקולה מוחלטת בין הקבצים המצורפים הנוגדן ננומטר. F = V (db) (F = כוח V = נפח, d = צפיפות microsphere הזכוכית, האצה = בגלל כוח הכבידה, b = צפיפות המים העקורים).

6. נציג תוצאות:

אם הכנה חרוז הוא נעשה בצורה נכונה, תהיה צבירה חרוז מינימום למרות שיש עדיין עשויים להיות גוש חרוז מזדמנים. כאשר נצפים מבעד היקף, לא אמורה להיות חלוקה סבירה של חרוזים אם לזווג או לא בחדר.

חשוב למזער את התנודות ככל האפשר, כדי לעשות את זה גם בטבלה אוויר, זעזוע מיוחד סופג מטר על חצובה כי בעל הר EQ, או על מערכת אשר מנצל מעיינות יכול לשמש לבידוד רעידות.

עוד טיפ שימושי בנוגע קאמרית תזרים אטום הוא לתת לו לעמוד במשך כחמש דקות על השולחן רמה אחרי זה נבנה באופן מלא. זה מאפשר לכל חרוזים גדולים פנויים לצוף במורד למאגר והשאר בשכבת nitrocellulose. אם את השקופית היו רכוב במקום ישירות עם השלמת, החוקר היה הרף צריך להתמודד עם חרוזים ממש טס דרך שדה הראייה, ואם זה קורה במהלך הרכישה וידאו זה יכול להשחית הדואר הניסוי. אם זה נעשה כראוי, טיסה חרוז ממוזער באופן משמעותי ותוצאות וידאו מנקה.

כאשר זוג חרוז פוטנציאל מזוהה על ידי המפעיל GFS, כדאי לשים אותו באמצעות סיבוב מקדים כדי לפקח על התנהגותם של השניים. לעיתים נדירות, חרוז גדול לא מודבקת היטב לשקופית. אם זה יקרה, אין טעם ניצול זוג כי זה קריטי, כי ככל מעוגן חרוז להישאר בתנוחה קבועה דרך תקופת הרכישה. אם זוג יציב ואינו התערוכה "גליל חרוז מעוגן," אז זה מתאים ניסויים.

העלילה של מרחקים ההפרדה חרוז לעומת שינוי בזווית ביחס הכובד ניתן להשתמש כדי להעריך את הנתונים רכשה. התוצאה נציג טוב יראה ההפרדה מעט על רמה וככל חרוז ניידים משחרר את עצמו מן חרוז מעוגן בגלל השפעת הכבידה, הגרף יראה הפרדה יותר. זה נמשך עד לשיא נחמד הוא הגיע הנקרא ד _מקס העקומה מתחילה ירידה שוב חוזר הבסיס d _דקות [תמונה 1]. בתנאים אידיאליים, חתימה זו היא סימטרית. התוצאה הלא נציג יראה גרף עם דפוסי מבולבל לא מראה ד ברורים _{דקות-d max-d} דפוס _דקות, או זה יראה הפרדות כי הם סדרי גודל גבוה מדי עבור מולקולה בודדת המעיד אולי היה פיסת אבק בין החרוזים, או אולי כי חרוז סלולרי פשוט לא היה מחובר בכלל. התהליך של מציאת זוג, ירי זה, זה עיבוד, וניתוח פערים יש לעצור רבים בהם זוגות חרוז ראוי ונבחרים החוצה. לכן, אם אתה מקבל בסופו של התהליך כולו יש לך אורך המולקולה העולה בקנה אחד עם התוצאות הקודמות, אפשר להיות בטוחים מאוד כי זוג חרוז המקורי הוא נציג יכולים להיכלל בתוצאות. ביום טוב, כמחצית ירה זוגות חרוז ניתן לקחת דרך להפוך נקודת נתונים לגיטימית. למשל, אורך של הסליל המפותל של שרירן בין MF20 MF30 ו נוגדנים, ידוע על בסיס EM נתונים AFM, נתונים לגישה 100 ננומטר ^2,7,8,9. אם התוצאה היא מספר פעמים זה אורך, מדגם יש מצטברים. התוצאות המוצגות כאן הן מניסויים תקן GFS סיבוב ולהפגין מרחק של 96 ננומטר ± 5 ננומטר, [איור 2] אשר מסכים הדוק עם מדידות של MF30 (אשר נקשר בתחנה הסופית-N של שרירן subfragment-2) ו MF20 (אשר נקשר ב meromyosin את האור) על מרחק ההפרדה נוגדן שרירן להסיק את ערכי הספרות [איור 3].

1. איור GFS תצורה. החלקים העיקריים של GFS מסומנים.

איור 2. סכמטי של עקרון GFS. בצד שמאל מראה centroid של ניידים חרוז במרחק מינימלי מ centroid של חרוז מעוגן. כפי GFS הוא הסתובב, ניידים חרוז מתיישר עם וקטור הכבידה אשר גם הוא פועל במקביל לציר של המולקולה קשור. במצב זה, המרחק בין centroids של חרוזים ניידים מעוגן נמצא לכל היותר. ימין למעלה מראה פרוסה נציג מסרט GFS. הימנית התחתונה היא תמונה של סיבוב GFS עוברת.

איור 3 מראה תוצאה נציג _דקות ד בצד שמאל של הגרף:. ד _{מקסימום} על הפרדה יחסית של 17.78 מיקרון; וחזרה _דקות ד סביב הבסיס של כ - 17.75 מיקרון של הפרדה יחסית בין החרוזים.

איור 4. התוצאה של הניסוי נציג סיבוב GFS מראה המרחק בין MF20 MF30 ואת הנוגדנים הממוצע 96 ננומטר. זה מייצג את המשך המשוער של S2.

איור 5. שרירן II dimer נהג להראות המצורפים ניתן לשימוש עם GFS כולל נוגדנים ו / או המצורפים אקטין. אפשרויות התקשרות שונים מאפשרת אסטרטגיות שונות GFS כדי למדוד אזורים שונים, או להחיל כוח בניצב או מקביל לתחום מוט של dimer שרירן.

Discussion

בעת המרת סרט ייצוג thresholded דיגיטלית, זה קריטי עבור התמונה thresholded לשמור על אותו אזור בכל מסגרת של וידאו. מכיוון חרוזים בזוג חרוז לנוע באופן עצמאי זה מזה, כל להיסחף בתחומים thresholded יכול גם לגרום המרחקים היחסית בין centroids של החרוזים להיסחף ולהציג טעות משמעותית. שליטה על אזור סף הפחית את השגיאה פי חמישה את המדידות במרחק 26 ננומטר עד 5 ננומטר. היא גם חיונית כדי להשיג מדידה מדויקת של רדיוס חרוזים הן כיחס בין החרוזים חשוב החישוב הסופי כי התשואות הן מרחק וערכים כוח.

המערכת יכולה להיות שונה במובנים רבים. מערכת האחרונה מקנה כוח מדורגים למולקולה קשור ידי הטלת GFS כולו כנגד קפיץ קבוע. לאחר קבוע הקפיץ נקבע, וידאו בגוף שלישי ניתן לקבל באותו זמן את הווידאו מיקרוסקופ נלקח ושני הם synched יחד. ואז כל מסגרת של וידאו ממצלמת את המיקרוסקופ ניתן לתת ערך כוח בהתאם למיקום של GFS כפי שהוא ירד בסרט, בגוף שלישי synched. כל מסגרת של וידאו בעל ערך כוח התואמים את החרוז הנייד הוא הקניית במהלך הסתיו ריבאונד הבאים של מערכת האביב. כל מסגרת של וידאו הוא ניתח גם לקבל את אורך המולקולה מוחלט. בדרך זו, בכל כוח בדידה יכול להיות בקורלציה למדידת מרחק כל בדידים, ולכן עקומת מדורגים כוח / מרחק זמין כדי לראות כיצד מולקולה אחת מתנהג תחת עומסים גוברת. טכניקה זו משמשת גם להכפיל את כוח microsphere יכול להקנות עד הכבידה פעמיים. כמו כן, נפח של חרוז הוא מה שקובע בסופו של דבר את הפרופיל כוח כמו המערכת מיועדת להיות ירד ממרחק זהה בכל פעם. לעומת זאת, בניסוי סיבוב תמיד רק נותן ערך אחד בכוח. אביזרים נוספים גם אפשרי כגון תאים זלוף, אוטומציה פלואורסצנטי, גדל, או אפילו מלכודות אופטיות. מאז תכונה אחת משמעותית של מערכת הבסיס הוא עלות נמוכה שלה חוסן, המערכת יכולה לשמש יחידה assay הפגנות מולקולה במעבדות חינוכיות.

יישומים עבור מערכת זו כבר הוכיחו שימושי לקביעת אופי המבניות של סליל מפותל של שרירן כמתואר נציג את התוצאות. בנוסף, הוא גם אישר את אורכי DNA 12 נ"ב לעומת נתונים AFM ו הראו תוצאות עקביות בנוגע כוח קרע של כפול ¹⁰ נוקליאוטידים תקועים. בגלל הגמישות בתנאי באמצעות נוגדן ספציפי באתר מצורפים או ligands אחרים או אפילו רעלים, GFS צפוי לייצר הרבה מבני נתונים מדעיים על הננומטרי של המבנה ואת picoscale כוחות. מולקולות ניתן למדוד, התמתח התגרו בנפרד בהתאם assay. מולקולות כבר תחת כוח במערכת יכולה להיות נתונה ריאגנטים לקבוע הולכת אותות אפשרי או הפעילות האנזימטית. האפשרויות ללימודי מולקולה בודדת נראה אינסופי בנקודה זו בזמן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyltriethoxysilane	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Sodium azide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimethyl Formamide	Extracted from Large New	D4254
Rabbit skeletal myosin II	Zealand White Rabbits (7-8)	NA
MF30 antibody (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20 antibody (6)	Hybridoma Bank	MF20
Lab microscope	Boreal	WW57905M00
Equatorial mount	Celestron	CG-5
Digital video cam	Sony Corporation	XCDV60
Caliper release	Cabelas	IA-415482
Compression spring	Jones Spring Co.	723
Extension spring	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & application	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA