Démonstration des utilisations du spectromètre force gravitationnelle roman de s'étirer et de mesurer les protéines fibreuses

Summary

Ceci est une étape-par étape indiquant l'objet, l'exploitation et des résultats représentatifs du spectromètre force gravitationnelle roman.

Abstract

L'étude de la structure macromoléculaire est devenue critique à l'élucidation des mécanismes moléculaires et de la fonction. Il ya plusieurs BioInstruments limité, mais important, capable de tester la dépendance vigueur de caractéristiques structurelles de protéines. Échelle a été un paramètre limitant de la précision avec les chercheurs peuvent les pairs dans le monde nanomécaniques de molécules, comme les acides nucléiques, enzymes et protéines motrices qui assurent maintien de la vie de travail. La microscopie à force atomique (AFM) est bien réglé pour déterminer les structures des protéines fibreuses natif avec une résolution de distance à égalité avec la microscopie électronique. Toutefois, dans les études de la force AFM, les forces sont généralement beaucoup plus élevé que une seule molécule pourrait l'expérience ^{1, 2.} Pièges optiques (OT) sont très bons à la détermination de la distance relative entre les billes piégées et qu'elles peuvent transmettre des forces très petit ^3. Cependant, ils ne donnent pas de précision longueurs absolues des molécules à l'étude. Simulations moléculaires fournissent des informations favorables à de telles expériences, mais ils sont limités dans la capacité à gérer les mêmes grandes tailles moléculaires, de longues périodes, et convaincre certains chercheurs en l'absence de preuves à l'appui d'autres ^{2, 4.}

La force gravitationnelle spectromètre (SFG) remplit un créneau essentiel dans l'arsenal d'un enquêteur en offrant une combinaison unique de capacités. Cet instrument est capable de générer des forces en général, avec 98% ou plus de précision de la gamme à la gamme femtonewton nanonewton. Les mesures de distance sont actuellement capables de résoudre la longueur moléculaire absolue à cinq nanomètres, et relative perles distances de séparation paire avec une précision semblable à un piège optique. En outre, le SFP peut déterminer étirement ou dévidage où la force est à proximité de l'équilibre, ou de fournir une force graduée de juxtaposer contre toute modification structurelle mesurée. Il est même possible de déterminer combien de résidus d'acides aminés sont impliqués dans des événements dérouler sous une force physiologique ^2. Contrairement à d'autres méthodes où il ya l'étalonnage vigueur vaste qui doit précéder toute épreuve, le SFP nécessite pas de calibration telle force ^5. En complétant les forces d'autres méthodes, le GFS combler les lacunes dans la compréhension de la nanomécanique de protéines essentielles et d'autres macromolécules.

Protocol

Introduction à la nouvelle configuration GFS

La SFP est constitué de plusieurs éléments essentiels: un microscope à lumière régulière, une monture équatoriale, une caméra et un ordinateur [Figure 1]. Les scellés de flux des cellules de chambre qui détient l'échantillon est également indispensable en fonction de la conception des SFP. Le microscope optique est monté sur la monture équatoriale de sorte que le champ peut être tourné dans différentes orientations dans l'espace. Cette capacité permet au vecteur statique de la gravité pour être exploitées de telle sorte que les échantillons peuvent être dynamiquement orienté par rapport au vecteur ainsi la force de gravité peut conférer des charges vigueur piconewton-gamme pour les échantillons. La caméra remplace la lentille oculaire du microscope optique afin qu'il puisse enregistrer des changements dans l'orientation de l'échantillon. Ces données brutes sont numérisées et manipulée par l'ordinateur pour interpréter les données en vigueur réelle et les mesures de distance. Les scellés de débit chambre est conçue pour permettre à tous les degrés de liberté dans l'espace sans perte d'échantillon. Dans la chambre se trouve la molécule de l'échantillon, qui est attaché près d'une extrémité à une "ancré" perle qui est collé à la surface de la chambre. Le terminus opposé est attaché à un "mobile" perle qui est libre de la surface de la chambre. C'est ce mobile perle, libre dans le tampon d'analyse qui peuvent être appliquées par la force gravitationnelle en sondant la molécule attachés à des charges de faible force [Figure 2]. L'échantillon ressemble simplement à une paire de microsphères sous le microscope, mais il ne prend une certaine expérience de discerner le bien utilisable paires couplées par leur attachement à une molécule à partir de couples où les deux perles sont assis sur la surface de l'écoulement de chambre. Une modification du système est l'ajout d'une plate-forme flottante qui détient le GFS et est suspendu par des ressorts. Dans cette configuration, une fois l'échantillon a été tourné dans une position où la force gravitationnelle peut agir sur l'échantillon, la plate-forme et toutes ses composantes peuvent être déposés contre la constante du ressort. Près de la chute libre, la force agissant sur le talon mobile est proche de zéro et à l'extension maximale des ressorts, la force gravitationnelle est multiplié par autant que deux fois. De cette façon, un gradué de force / distance de la réponse peuvent être représentées graphiquement afin de mesurer le comportement d'une molécule unique à des charges différentes vigueur.

1. Préparation de microsphères

1. Immergez environ 10 mg de billes de verre ou de silice dans 0,04% de 3-aminopropyltriéthoxysilane (coupé avec de l'acétone) pour deux minutes.
2. Rincer avec deux changements d'eau bidistillée et centrifuger pour sédimenter à 2000 xg pendant 5 minutes. Rejeter le surnageant.
3. Ajouter 5 ml de tampon de couplage (0,01 M pyridine coupé avec de l'eau doublement distillée et ajuster le pH à 6,0), et agiter ce mélange vigoureusement. Centrifuger comme décrit ci-dessus. Répétez cette étape trois fois.
4. Pour le gâteau humide de perles, ajouter 2 mL de la solution glutaraldéhyde à 5% (coupé glutaraldéhyde avec le tampon de couplage). Agiter vigoureusement.
5. Sous une hotte, tourner talon mélange / glutaraldéhyde pendant 3 heures à température ambiante.
6. Centrifuger comme ci-dessus et aspirer le surnageant.
7. Laver les billes dans 5 ml de tampon de couplage, en les secouant vigoureusement et centrifuger et aspirer le surnageant. Répétez ceci trois fois.
8. Ajoutez environ 15 pi de l'anticorps désiré à des billes et agiter vigoureusement. Les perles devrait être tourné pendant 16-24 heures.
9. Sous le capot, ajoutez 5 ml de solution 1 M trempe glycine (glycine coupé à l'eau distillée double et ajuster le pH à 7,0). Agiter vigoureusement le mélange et faire tourner pendant 30 minutes.
10. Centrifugeuse et aspirer le surnageant.
11. Ajouter 5 ml de tampon de lavage (0,01 M Tris, pH 7,0; azide de sodium 0,1%, 0,1% de BSA; 0,15 M de NaCl et 0,001 M EDTA). Agiter vigoureusement ce, centrifugeuse et aspirer le surnageant. Répétez cette étape trois fois supplémentaires.
12. Changer de tampon à faible teneur en sel du tampon (0,1 M de KCl, 0,02 M d'imidazole; MgCl2 5 _mM, ajuster le pH à 7,0). Répétez trois fois.

2. Pièce jointe échantillon à des microsphères

1. Prenez une petite quantité de billes préparées (environ 2 pi de chaque gâteau de perles cependant, si il ya un grand écart de diamètre entre les lots, il est avantageux d'utiliser un ratio autour de 08:01 du grand pour de petites perles) et les ajouter à un microtube avec le tampon de dosage. Réduire la concentration de votre protéine d'environ 5 uM, en utilisant le tampon de dosage. Préparer au moins un volume total de 400 ul, y compris le tampon, les protéines et les perles.
2. Tournez ce mélange à environ 1 RPM pour 3 heures (si la protéine est trop agitée, elle sera totale et deviennent inutiles).

3. Préparation Chambre Glissez

1. Manteau une lame de microscope d'épaisseur avec de la nitrocellulose 0,01% (dans l'acétate d'amyle). Laissez cette diapositive à sec pendant environ 10 minutes.
2. Avec un coupe-verre tranchant, couper couvercle coulissant de manière à faire une chambre. Cela nécessite quatre bandes de verre.
3. Utilisez le faitORY bord du verre et râteau c'est à travers un frottis de graisse à vide des deux côtés de la bordure.
4. Bandes de graisse presse enduit sur nitrocellulose séchée couvertes glisser pour créer une boîte sur la surface de la lame.
5. Pipeter environ 2 ul de mélange billes / protéine en tapant sur pipetteur surface du verre intérieur de la boîte.
6. Ajouter environ 20 à 400 ul de tampon faible teneur en sel selon la taille de la chambre est.
7. Appuyez sur une lamelle sur le dessus de la boîte qui est déjà enduite de graisse à vide pour terminer la chambre étanche et tamponné.
8. Laissez glisser assis sur un plateau de sorte que le perles ont largement le temps de s'ancrer à la nitrocellulose.

4. GFS Acquisition de données

1. Glisser sur le mont GFS étape
2. Surveiller ce que l'appareil d'enregistrement et de GFS est légitime de rechercher des "paires perles», dans lequel la microsphère petite est fixé près de l'équateur de la microsphère grande.
3. Quand une paire est trouvée potentiels perles, passer par la profondeur de champ afin de déterminer si les "mobiles" perle ne se repose pas sur la surface de la lame.
4. Une fois une paire appropriée est identifiée, noter l'angle mobiles perle est loin de d _max (d _max = la distance maximale entre les centroïdes des microsphères couplées). Déplacer le champ en position d'acquérir la vidéo.
5. L'angle de déplacement de la SFP devraient être suffisants pour enregistrer d _min, d _{max, min} et D qui pourrait appeler des 25-90 degrés en fonction de la longueur de la molécule.
6. RECORD que la paire se déplace de d _min à d _max et revenir à d _min.
7. C'est une bonne idée aussi de tourner un film sur le fond de sorte qu'il peut être soustraite tard pour analyse.
8. Si vous effectuez une baisse GFS, déplacez le champ Retour à d _max et d'enregistrer la baisse à au moins 60 images par seconde. La partie critique est la première oscillation, mais un temps record à long peut aussi être utilisé pour l'étude dynamique.

5. GFS Data Analysis

1. Transformez la vidéo brutes en numérique "seuillée" l'image et exécuter des macros dans ImageJ pour déterminer la position centroïde de chaque bille dans chaque image de la vidéo. C'est aussi pour la vidéo-déposer.
2. Dump de l'X, Y et données de la zone d'ImageJ dans Excel et tracer les points.
3. Si une paire correcte perle a été acquis par la vidéo, une bosse visible dans le graphique est révélatrice des perles étant au plus proche de leur (d _min) et à l'apex de la courbe est la position de d _max.
4. Grâce à ces données, le rayon de chaque bille doit être déterminée précisément dans ImageJ et toutes ces informations sont mises dans l'équation imbriquées:
   d = [(g sin α) ² + (g cos α + d _max - g) ^{2] 0.5}
   g = [D + R ² _{min b} ² - (R _a + r _b) ^2] = ^0,5 R β sin _b
   C = D _max - R _a - g
   (D = distance entre centroïdes, g = force de gravité; α = l'angle en degrés parallèles à l'objectif; r _b = rayon de la téléphonie mobile bourrelet; r = rayon de _une ancré bourrelet; β = angle de l'attachement hors de l'axe de l'équateur de l'ancrage de perles.
5. En utilisant le rayon équipé du mobile bourrelet qui donne aussi son volume, et étant donné la densité de la bille, la force de la perle mobiles confère à la molécule peut être calculé de piconewtons après la flottabilité du solvant est soustraite. Cette méthode mesure la force sur la molécule attaché dans piconewtons et calcule la longueur molécule absolue entre les pièces jointes d'anticorps en nanomètres. F = V (db) a (F = force, V = volume, d = densité de la microsphère de verre, une accélération = due à la pesanteur, b = la densité de l'eau déplacée).

6. Les résultats représentatifs:

Si la préparation des billes est fait correctement, il y aura moins d'agrégation perles bien qu'il y ait peut-être encore une motte occasionnels perle. Lorsqu'on regarde à travers le champ, il devrait y avoir une répartition raisonnable de perles si jumelé ou non dans la chambre.

Il est important de minimiser les vibrations, autant que possible, pour cela soit une table de l'air, aux chocs spéciale absorbant les pieds d'un trépied qui détient une monture EQ, ou sur le système qui utilise des ressorts peuvent être utilisés pour l'isolation des vibrations.

Une autre astuce utile sur la chambre de circulation étanche est de la laisser reposer pendant environ cinq minutes sur une table de niveau après qu'elle a été entièrement construite. Cela permet à toutes les billes seules grandes flotter à travers le tampon et le repos dans la couche de nitrocellulose. Si la lame ont été montées à la place directement à la fin, l'enquêteur serait continuellement avoir à traiter avec des perles littéralement voler à travers le champ de vision, et si cela se produit lors de l'acquisition vidéo, il peut corrompre èmeexpérimentation électronique. Si cela est fait correctement, le vol est considérablement minimisé perles et des résultats vidéo plus propre.

Quand une paire potentiels perle est identifié par l'opérateur GFS, il est utile de le mettre dans une rotation préliminaire pour surveiller le comportement de la paire. Rarement, la grosse perle n'est pas solidement fixée à la diapositive. Si cela arrive, il est inutile dans l'utilisation de la paire, car il est essentiel que le plus grand ancré séjour perles dans une position fixe pendant toute la durée de l'acquisition. Si le couple est stable et ne présente pas «ancré rouleau perles», puis il est adapté à l'expérimentation.

Une parcelle de distances de séparation billes par rapport au changement de l'angle par rapport à la gravité peut être utilisé pour évaluer les données acquises. Un résultat bon représentant montrerait guère de séparation sur un plateau et que le cordon de mobiles se libère de la perle ancré raison de l'influence de la gravité, le graphique montrera plus de séparation. Cela continue jusqu'à un pic de Nice est atteint ce qui est appelé d _max et la courbe commence à la baisse à nouveau retourner à la base d _min [Figure 1]. Dans des conditions idéales, cette signature est symétrique. Un résultat non représentatif serait afficher un graphique avec des motifs incohérents ne montrant aucun distinctes d _min-max d-d pattern _min, ou elle montrerait les séparations qui sont des ordres de grandeur trop élevé pour une seule molécule indiquant peut-être il y avait un morceau de poussière entre les perles, ou peut-être que le talon du mobile a été tout simplement pas attachés du tout. Le processus de trouver la paire, c'est le tir, c'est le traitement, et il analyse les lacunes a cesser de nombreux cas où incorrecte paires perles sont abattues sur. Donc, si vous arrivez à la fin du processus dans son ensemble et vous avez une longueur molécule qui est conforme aux résultats précédents, on peut être très confiants que la paire originale perle est représentatif et peut être inclus dans les résultats. Dans un bon jour, environ la moitié de la prise de perles paires peuvent être prises par le biais de devenir un point légitimes des données. Par exemple, la longueur de la bobine enroulée de la myosine entre les MF20 MF30 et les anticorps, est connue basée sur les données EM et de l'AFM, les données à l'approche de 100 nm ^2,7,8,9. Si le résultat est plusieurs fois cette longueur, l'échantillon a agrégées. Les résultats présentés ici sont tirées des expériences standard de rotation GFS et démontrer une distance de 96 nm ± 5 nm, [Figure 2], qui accepte en étroite collaboration avec les mesures de la MF30 (qui se lie à l'extrémité N-terminale de la myosine sous-fragment-2) et MF20 (qui se lie dans le meromyosin lumière) la distance de séparation d'anticorps sur la myosine déduite des valeurs littérature [Figure 3].

Figure 1. Configuration de GFS. De grandes parties de GFS sont étiquetés.

Figure 2. Schéma de principe GFS. Le côté gauche montre centroïde de la téléphonie mobile perle à une distance minimale de centroïde de billes ancrées. Comme GFS est tournée, mobiles perles aligne avec le vecteur de gravité qui est aussi parallèle à l'axe de la molécule attachés. Dans cette position, la distance entre les centroïdes des perles mobiles et ancrés est à son maximum. En haut à droite montre une tranche représentative d'un film de GFS. En bas à droite est une image de la rotation GFS subir.

Figure 3 résultat représentatif montrant _min D sur la gauche du graphique;. D _max à une séparation relative de 17,78 microns et un retour à la _vitamine D dans la ligne de base d'environ 17,75 microns de séparation relative entre les billes.

Figure 4. Résultat représentatif de l'expérience de rotation GFS montrant la distance entre MF20 MF30 et anticorps en moyenne 96 nm. Cela représente la durée approximative de S2.

Figure 5. Myosine II dimère utilisé pour afficher les pièces jointes possibles pour une utilisation avec le GFS, y compris d'anticorps et / ou les pièces jointes d'actine. Différentes possibilités de fixation permet de différentes stratégies de GFS pour mesurer les différentes régions, ou pour demander force perpendiculaire ou parallèle à la tige de domaine du dimère de myosine.

Discussion

Lors de la conversion d'un film à une représentation numérique seuillée, il est crucial pour l'image seuillée pour maintenir la même région, dans chaque image de la vidéo. Parce que les perles dans une paire de billes se déplacent indépendamment les uns des autres, toute dérive dans les zones seuillée peuvent aussi causer les distances relatives entre les centroïdes des perles à la dérive et d'introduire des erreurs significatives. Contrôle de la zone seuil réduit l'erreur de cinq fois dans les mesures de distance de 26 nm à 5 nm. Il est également crucial d'obtenir une mesure précise de rayon pour les deux perles comme le rapport entre les billes est importante pour le calcul final qui donne la distance et des valeurs de force.

Le système peut être modifié de plusieurs façons. Le système le plus récent confère la force graduée à la molécule attachés en laissant tomber l'ensemble du SFP contre un ressort constant. Une fois la constante de printemps est déterminée, d'une vidéo à la troisième personne peut être obtenue dans le même temps la vidéo microscope est pris et les deux sont synchronisés ensemble. Ensuite, chaque image de la vidéo de la caméra microscope peut être donné une valeur de force en fonction de la position de la SFP comme il est tombé à la troisième personne, un film synchronisé. Chaque image de la vidéo a une valeur d'effort correspondant que le talon du mobile est transmettre durant l'automne et le rebond ultérieur du système à ressort. Chaque image de la vidéo est également analysée pour obtenir la longueur molécule absolue. De cette façon, chaque force discrète peut être corrélée à chaque mesure de distance discrète, donc une force de gradué / distance courbe est disponible pour voir comment se comporte une molécule sous les charges augmentent. Cette technique sert aussi à multiplier la force une microsphère peut donner jusqu'à deux fois la gravité. De même, le volume de la bille est ce qui détermine finalement le profil de force que le système est conçu pour être lâché de la même distance à chaque fois. En revanche, l'expérience de rotation donne toujours une seule valeur la force. Des accessoires supplémentaires sont également possibles telles que les cellules de perfusion, la fluorescence, une automatisation accrue, ou encore des pièges optiques. Depuis une caractéristique importante du système de base est son faible coût et de robustesse, le système pourrait être utilisé pour des démonstrations simples de dosage dans les laboratoires molécule d'enseignement.

Les applications pour ce système ont déjà avéré utile pour déterminer la nature structurelle de la bobine enroulée de la myosine comme décrit dans les résultats représentatifs. En outre, il a également confirmé les longueurs de 12 pb par rapport à l'ADN de données de l'AFM et montré des résultats cohérents concernant la force de rupture de l'bicaténaire ¹⁰ nucléotides. En raison de la flexibilité offerte par le site en utilisant des pièces jointes d'anticorps spécifiques ou d'autres ligands ou même des toxines, la SFP est aujourd'hui idéalement positionné pour générer autant de données scientifiques structurelle à l'échelle nanométrique de la structure et le picoscale des forces. Les molécules peuvent être mesurés, étirées, et taquiné dehors selon le dosage. Molécules déjà en vigueur dans le système peut être soumis à des réactifs pour déterminer la transduction du signal possible ou l'activité enzymatique. Les possibilités d'études de la molécule unique semblent infinies, à ce point dans le temps.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Aminopropyltriethoxysilane	Polysciences, Inc.	919-30-2
Acetone	Fisher Scientific	A18P-4
Pyridine	Sigma-Aldrich	110-86-1
Glutaraldehyde	Fisher Scientific	G7776
Glycine	Research Organics	BP381-1
Tris	Sigma-Aldrich	9682T
Sodium azide	Amresco	71289
BSA	Sigma-Aldrich	AMR-0332-100G
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
EDTA	MSI	E9884
Nitrocellulose	Sigma-Aldrich	60443
N-N Dimethyl Formamide	Extracted from Large New	D4254
Rabbit skeletal myosin II	Zealand White Rabbits (7-8)	NA
MF30 antibody (9-10)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MF30
MF20 antibody (6)	Hybridoma Bank	MF20
Lab microscope	Boreal	WW57905M00
Equatorial mount	Celestron	CG-5
Digital video cam	Sony Corporation	XCDV60
Caliper release	Cabelas	IA-415482
Compression spring	Jones Spring Co.	723
Extension spring	Jones Spring Co.	770
ImageJ	National Institutes of Health	NA
Fire-i drivers & application	Unibrain	3.80
Excel	Microsoft	NA