Summary
Это шаг за шагом руководство показывает цель, эксплуатации и репрезентативные результаты из романа гравитационного спектрометра силу.
Abstract
Исследование макромолекулярных структуры стало критическим для выяснения молекулярных механизмов и функций. Есть несколько ограничен, но важно bioinstruments способны тестирования силу зависимости структурных особенностей в белках. Шкала была предельным параметром от того, насколько точно исследователи могут заглянуть в наномеханические мире молекул, таких, как нуклеиновые кислоты, ферменты и моторных белков, которые выполняют поддержания жизни работу. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) хорошо настроены, чтобы определить родной структуры волокнистых белков с расстояния разрешение на одном уровне с электронной микроскопии. Тем не менее, в АСМ исследования силы, силы, как правило, намного выше, чем одной молекулы могут возникнуть 1, 2. Оптические ловушки (OT) очень хороши при определении относительного расстояния между ловушке бисером, и они могут придать очень малыми силами 3. Тем не менее, они не дают точных абсолютных длин молекул в стадии изучения. Молекулярное моделирование обеспечить вспомогательная информация для таких экспериментов, но они ограничены в способности обрабатывать же больших молекулярных размеров, длинные сроки, и убедить некоторые исследователи при отсутствии других подтверждающих документов, 2, 4.
Силы гравитационного спектрометра (GFS) заполняет нишу в критическом арсенал следователя, обеспечивая уникальное сочетание способностей. Этот прибор способен генерировать сил как правило, с 98% или большей точностью из диапазона femtonewton в диапазоне nanonewton. Измерения расстояний в настоящее время способны решить абсолютной молекулярной длиной до пяти нанометров, и относительная бусинка пара разделение расстояния с точностью, похожа на оптической ловушке. Кроме того, GFS может определить, растяжение или разматывание, где сила вблизи равновесия, или предоставить градуированной силы противопоставить против любых измеряемых структурных изменений. Возможно даже, чтобы определить, сколько аминокислотных остатков, которые участвуют в раскручивании событий в физиологических перегрузок 2. В отличие от других методов, где есть обширные калибровки сила, которая должна предшествовать любой анализ, GFS не требует такой калибровки силы 5. Дополняя сильные стороны других методов, GFS будет восполнить пробелы в понимании наномеханики жизненно белков и других макромолекул.
Protocol
Введение в Новый GFS Конфигурация
GFS состоит из нескольких основных компонентов: регулярные световой микроскоп, монтировки, камеры, и компьютер [Рисунок 1]. Запечатанных поток-клеточной камеру, которая держит образец также необходимы в соответствии с проектом СГФ. Свет микроскоп устанавливается на экваториальную монтировку таким рамки могут быть повернуты в разные ориентации в пространстве. Эта способность позволяет статический вектор гравитации для эксплуатации, так что образцы могут быть динамически ориентированной по отношению к вектору поэтому сила тяжести может передать piconewton дальности нагрузки силой до образцов. Камера заменяет глазной линзы оптического микроскопа так, чтобы он может записывать изменения в ориентации образца. Это исходные данные в цифровую форму и обрабатываются с помощью компьютера для интерпретации данных в реальную силу и измерения расстояния. Запечатанных потока камера предназначена для обеспечения всех степеней свободы в пространстве без потери образца. В камере находится образец молекулы, который привязан возле одного конца к "якорь" шарик, который приклеивается к поверхности камеры. Противоположным концом привязан к "мобильной" шарик, свободной от поверхности камеры. Именно это мобильная бисером, бесплатно в буфер, который может быть действием гравитационной силы тем самым растягивая привязаны молекулы при таких низких нагрузках силы [Рисунок 2]. Образец просто выглядит как пара микросферы под микроскопом, хотя для этого надо некоторый опыт, чтобы различать добро использовать пар связаны их привязанность к молекуле из пар, где оба бисером сидят на поверхности потока камеры. Одна из модификаций к системе добавлением плавающей платформе, которая держит GFS и подвешен на источники. В этой конфигурации, когда образец был повернут в положение, где гравитационные силы могут действовать на образец, платформы и все его компоненты могут быть удалены от пружины. Ближний свободного падения, сила, действующая на мобильный бусинка близка к нулю, а при максимальном расширении источников, гравитационная сила умножается на целых два раза. Таким образом, градуированной силы / расстояние ответ может быть графически измерить поведение одной молекулы на разных нагрузках силу.
1. Подготовка Микросфера
- Погрузите около 10 мг стекла или кварца бусины 0,04% 3-аминопропилтриэтоксисилана (вырезать с помощью ацетона) в течение двух минут.
- Промыть два изменения двойного дистиллированной воды и центрифуга для осаждения при 2000 XG в течение 5 минут. Удалите супернатант.
- Добавьте 5 мл связи буфера (0,01 М пиридин вырезать с двойной дистиллированной воды и отрегулировать рН до 6,0), и поколебать эту смесь энергично. Центрифуга, как описано выше. Повторите это действие три раза.
- Для мокрой торт из бисера, добавить 2 мл 5% gluteraldehyde решение (сократить gluteraldehyde с муфтой буфера). Встряхивать.
- Под капотом, вращать шарик / gluteraldehyde смесь в течение 3 часов при комнатной температуре.
- Центрифуга, как выше, и аспирата супернатант.
- Вымойте бисером в 5 мл буфера связи, встряхивая их энергично и центрифуги и аспирации супернатант. Повторите это еще три раза.
- Добавить примерно 15 мкл антител к желаемой бисером и энергично встряхивают. Бисер должен быть повернут на 16-24 часов.
- Под капотом, добавляют 5 мл 1 М раствора глицина закалки (вырезать глицин с двойным дистиллированной воды и отрегулировать рН до 7,0). Встряхнуть эту смесь энергично и поверните на 30 минут.
- Центрифуга и аспирации супернатант.
- Добавьте 5 мл промывочного буфера (0,01 М Трис, рН 7,0; 0,1% азида натрия, 0,1% BSA; 0,15 М NaCl и 0,001 М ЭДТА). Встряхните это энергично, центрифуги и аспирации супернатант. Повторите этот шаг еще три раза.
- Изменение буфера с низким содержанием соли буфере (0,1 М KCl, 0,02 М имидазола; 5 мМ MgCl 2; приспособиться к рН 7,0). Повторите три раза.
2. Пример Приложение к Микросферы
- Возьмите небольшое количество подготовленных бисера (около 2 мкл из каждого торта из бисера однако, если есть большое расхождение в диаметре между партиями, то целесообразно использовать около 8:01 отношение велико, чтобы маленьких шариков) и добавить их в микроцентрифужных трубка с буфером. Уменьшить концентрацию вашего белка около 5 мкм, с использованием буфера. Подготовка по крайней мере общем объеме 400 мкл в том числе буфера, белок, и бисером.
- Поверните эту смесь на уровне около 1 RPM в течение 3 часов (если белок перемешивают слишком много, это будет агрегировать и становятся бесполезными).
3. Подготовка слайдов палаты
- Шерсть толстая микроскопический слайд с 0,01% нитроцеллюлозы (в ацетат амиловый). Пусть этот слайд сохнуть в течение приблизительно 10 минут.
- При резком резак стекла, вырезать крышку слайд так, чтобы камера. Для этого требуется четыре полосы из стекла.
- Воспользоваться тем,Теория краю стекла и грабли его через мазок вакуумной смазкой по обе стороны края.
- Пресс смазки стрипов на сушеные нитроцеллюлозы покрыты слайд, чтобы создать поле на поверхности слайда.
- Внесите около 2 мкл из бисера / белковая смесь, нажав pipetter на поверхности стекла внутри коробки.
- Добавьте примерно 20-400 мкл буфера низкой соли в зависимости от размера камеры.
- Пресс покровным стеклом в верхней части окна, которое уже покрытые вакуумной смазки закончить опечатаны и буфер камеры.
- Давайте слайд сидеть на ровном месте так бисером иметь достаточно времени, чтобы закрепить себя нитроцеллюлозы.
4. GFS сбора данных
- Горы слайд на GFS этапе
- Монитор, что камера находится в режиме записи GFS и искать законные "шарик пар", в которой небольшие микросфер прикрепляется вблизи экватора большой микросфер.
- Когда потенциальный бусинка пара найдена, пройти через глубину резкости, чтобы определить, "мобильный" шарик не почивает на поверхности слайда.
- Как только подходящую пару определена, отметьте угол мобильных шарик от D Max (г макс = максимальное расстояние между центрами тяжести из спаренных микросфер). Перемещение рамки в состоянии приобрести видео.
- Угол поездки СГФ должна быть достаточной для записи г мин, макс г и г мин, которые могут потребовать 25-90 градусов в зависимости от длины молекулы.
- ЗАПИСЬ как пара путешествует из г мин до D Max и обратно к г мин.
- Это хорошая идея также снимать фильм фон поэтому он может быть вычтен позже для анализа.
- При выполнении падение GFS, переместить сферу обратно в D Max и записывать падение по крайней мере в 60 кадров в секунду. Важной частью является первым колебаний, но длительное время записи может быть также использован для динамического исследования.
5. Анализ данных СГФ
- Преобразование сырого видео в цифровом "thresholded" образ и запустить макрос в ImageJ для определения тяжести положение каждой бусины в каждом кадре видео. Это также падение видео.
- Дамп X, Y и область данных из Excel в ImageJ и сюжет точек.
- Если правильный шарик пары было приобретено видео, заметным горбом на графике указывает на бисер находясь на своих ближайших (г мин) и на вершине графа положение D макс.
- Используя эти данные, радиус каждой бусины должны быть определены именно в ImageJ и вся эта информация вводится в вложенных уравнение:
г = [(г грех α) 2 + (г сов α + D Max - г) 2] 0,5
г = [г мин 2 + R B 2 - (г + г б) 2] 0,5 = г б греха β
С = D макс - г - г
(D = расстояние между центрами тяжести; г = сила тяжести; α = угол в градусах параллельно объектива; R B = радиус мобильных бусинка, г = радиус якорь борт; β = угол крепления от оси экватора на якоре шарик. - Использование установлен радиус мобильных шарик, который также дает его объем, а также учитывая плотность шарик, сила мобильных шарик передает в молекуле может быть рассчитана в piconewtons после плавучесть растворитель вычитаются. Этот метод измеряет силу привязаны молекулы в piconewtons и вычисляет абсолютные длины молекулы антител между вложениями в нанометрах. F = V (дБ) (F = сила, V = объем, D = плотность стекла микросфер, ускорение = силы тяжести, б = плотность вытесненной воды).
6. Представитель Результаты:
Если приготовительные шарик будет сделано правильно, то будет минимальным бусинка агрегации хотя все еще может быть случайный бусинка комок. Если смотреть через прицел, не должно быть разумное распределение бисером ли парные или нет в камере.
Важно, чтобы свести к минимуму вибрации как можно больше, для этого либо воздуха таблицы, специальные амортизирующие ног штатива, который содержит эквалайзер гору, или на системы, которая использует источники могут быть использованы для виброизоляции.
Другой полезный совет относительно закрытой камерой поток дать ему постоять минут пять на уровне таблицы после того, как была полностью построена. Это позволяет любому одиноких больше бусин, чтобы плыть через буфер и отдых в слой нитроцеллюлозы. Если слайд вместо этого были установлены непосредственно после завершения, следователь будет постоянно иметь дело с бисером буквально летать по полю зрения, а если это происходит во время видео приобретения он может повредить йэлектронной эксперимента. Если это сделано правильно, бусинка полета значительно минимизированы и чище результаты видео.
Когда потенциальный бусинка пара определяется оператором GFS, полезно поставить его через предварительный вращения контролировать поведение пары. Редко, большая бусина не плотно прикреплены к слайду. Если это произойдет, нет никакого смысла в использовании пара потому что очень важно, что чем больше на якорь борт пребывания в фиксированном положении по продолжительности приобретения. Если пара устойчива и не проявляет "якорь борт ролл", то она подходит для экспериментов.
Сюжет шарик расстояния разделения по сравнению с изменением угла по отношению к гравитации может быть использована для оценки полученных данных. Хороший результат представителя бы не проявляют большого разделения на плато и в качестве мобильного бусинка освобождает себя от якорь борт из-за влияния силы тяжести, график покажет более разделения. Это продолжается, пока хорошо пик достигнут, которая называется D Max и вниз кривая начинает снова возвращаясь к базовым г мин [Рисунок 1]. В идеальных условиях эта подпись является симметричной. Нерепрезентативной результат показал бы граф с некогерентной моделей показывает нет четких г-й мин макс-й мин шаблону, или это будет свидетельствовать о том, что разделение на порядки слишком высока для одной молекулы указывает, может быть, там был кусок пыли между бусы, или, может быть, что мобильный шарик просто не привязан вообще. Процесс поиска пары, стрельба его, ее обработки и анализа она имеет много пробелов остановки, где неправильное бусинка пары взятые из. Так что, если вы дойдете до конца весь процесс и у вас есть молекулы длина, которая согласуется с ранее полученными результатами, можно быть абсолютно уверены, что оригинальная бусина пара представительных и могут быть включены в результаты. В хороший день, около половины бусинка выстрел пары могут быть приняты путем, чтобы стать законной точки данных. Например, длина спиральной катушки миозина между MF20 и MF30 антител, как известно, на основе ЭМ данных и AFM, данные на подходе 100 нм 2,7,8,9. Если результат в несколько раз эта длина, образец имеет суммируются. Результаты, представленные здесь, из экспериментов стандартных GFS вращения и продемонстрировать расстоянии 96 нм ± 5 нм, [2], которая хорошо согласуется с измерениями MF30 (который связывается на N-конце субфрагмента-2) и MF20 (которая связывает в свете меромиозина) антител расстояние разделения на миозина выводится из литературы значения [Рисунок 3].
Рисунок 1. GFS конфигурации. Основные части GFS помечены.
Рисунок 2. Схема принципа СГФ. Левая сторона показывает, центр тяжести мобильных бусину на минимальном расстоянии от центра тяжести на якоре шарик. Как GFS поворачивается, мобильные бусинка выравнивается с векторной гравитации, которая также работает параллельно с осью привязаны молекулы. В этом положении, расстояние между центрами тяжести подвижных и стал на якорь бисера на максимум. Вверху справа показывает, представитель ломтик из фильма СГФ. Внизу справа находится образ GFS проходит поворот.
Рисунок 3 представителя результат, показывающий, г мин слева от графа;. Г макс при относительной разделения 17,78 мкм; и возвращение к г мин вокруг базовых около 17,75 мкм относительного расстояния между бусинами.
Рисунок 4. Представителю результате GFS вращения эксперимент показывает расстояние между MF20 и MF30 антител среднем 96 нм. Это составляет приблизительную продолжительность S2.
Рисунок 5. Миозина II димера используется, чтобы показать возможные вложения для использования с GFS в том числе антитела и / или актина вложений. Различные варианты вложений позволяет для различных стратегий GFS для измерения различных регионах, или применить силу перпендикулярно или параллельно стержень области димера миозина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При конвертировании фильма в цифровом thresholded представление, оно имеет решающее значение для thresholded изображение для поддержания той же области в каждом кадре видео. Из бисера в бисер пары движутся независимо друг от друга, любой дрейф в thresholded области могут также вызвать относительные расстояния между центроиды бисером дрейф и внести существенные ошибки. Контроль порога области уменьшается ошибка в пять раз за расстояний от 26 нм до 5 нм. Очень важно также, чтобы получить точные измерения радиуса для бусин, как соотношение между бисером имеет важное значение для окончательного расчета, что дает расстояния и силы ценностей.
Система может быть изменен разными способами. Последние системы придает градуированным силой привязал молекулы, понижая весь GFS против пружины. Как только пружины определяется, от третьего лица, видео может быть получена в то же время микроскоп видео будет браться и оба они синхронизированы друг с другом. Тогда каждый кадр видео с камеры микроскопа можно дать значение силы в соответствии с положением СГФ как она упала в третьем лице, синхронизированы фильм. Каждый кадр имеет соответствующее значение силы, которая мобильных бусинка придания во время падения и последующего отскока весной системы. Каждый кадр видео также проанализированы для получения абсолютной длины молекулы. Таким образом, каждый дискретный сила может быть соотнесена с каждого дискретного измерения расстояния, таким образом, градуированной силы / расстояние кривой можно видеть, как одна молекула ведет себя при увеличении нагрузки. Эта техника также служит для умножения силы микросфер может передать в два раза тяжести. Аналогичным образом, объем бусинка, что в конечном итоге определяет силу профиля как система предназначена для сбрасывается с той же расстояние в любое время. В отличие от вращения эксперимент всегда дает только одна сила значение. Дополнительные аксессуары также возможны такие как перфузии клеток, флуоресценция, повышение степени автоматизации, или даже оптические ловушки. С одной существенной особенностью базы системы является ее низкая стоимость и надежность, система может быть использована для одной молекулы анализа демонстраций в учебных лабораториях.
Приложений для этой системы уже доказали свою полезность для определения структурный характер спиральный виток миозина, как описано в репрезентативные результаты. Кроме того, он также подтвердил, длины ДНК 12 б.п. по сравнению с АСМ данных и показал устойчивые результаты, касающиеся разрыва силу двухцепочечную нуклеотидных 10. Из-за гибкости, обеспечиваемой с помощью конкретного участка вложения антител или других лигандов или даже токсины, GFS готова генерировать много научных структурных данных на наноуровне структуры и picoscale сил. Молекулы могут быть измерены, потянулся и дразнят друг от друга в зависимости от теста. Молекулы уже под силу в системе может быть подвергнут реагентов для определения возможной передачи сигнала или ферментативной активности. Возможности для единичных исследований молекулы кажутся бесконечными в этот момент времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Этот материал основан на работе, при поддержке Национального научного фонда под грант № 0842736.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane | Polysciences, Inc. | 919-30-2 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 110-86-1 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | G7776 | |
| Glycine | Research Organics | BP381-1 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | 9682T | |
| Sodium azide | Amresco | 71289 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | AMR-0332-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | MSI | E9884 | |
| Nitrocellulose | Sigma-Aldrich | 60443 | |
| N-N Dimethyl Formamide | Extracted from Large New | D4254 | |
| Rabbit skeletal myosin II | Zealand White Rabbits (7-8) | NA | |
| MF30 antibody (9-10) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MF30 | |
| MF20 antibody (6) | Hybridoma Bank | MF20 | |
| Lab microscope | Boreal | WW57905M00 | |
| Equatorial mount | Celestron | CG-5 | |
| Digital video cam | Sony Corporation | XCDV60 | |
| Caliper release | Cabelas | IA-415482 | |
| Compression spring | Jones Spring Co. | 723 | |
| Extension spring | Jones Spring Co. | 770 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | NA | |
| Fire-i drivers & application | Unibrain | 3.80 | |
| Excel | Microsoft | NA |
References
- Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
- Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin. Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).
- Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers. Nature. 377, 251-254 (1995).
- Gawalapu, R. K., Root, D. D. Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft. Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).
- Kellermayer, M. S. Z. Visualizing and manipulating individual protein. Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).
- Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin. J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).
- Godfrey, J. E., Harrington, W. F. Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment. Biochemistry. 9, 886-893 (1970).
- Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer. Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).
- Xu, J., Root, D. D. Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface. Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).
- Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy. Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).
