Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Demonstrera användning av Novel gravitationskraften Spektrometer att stretcha och Mät Fibrer Proteiner

Published: March 19, 2011 doi: 10.3791/2624

Summary

Detta är ett steg för steg guide som visar syfte, drift och representativa resultat från romanen gravitationskraften spektrometer.

Abstract

Studiet av makromolekylära struktur har blivit avgörande att klarlägga molekylära mekanismer och funktion. Det finns flera begränsade, men viktiga bioinstruments kan testa styrkan beroende av strukturella drag i proteiner. Skala har varit en begränsande parameter på hur exakt forskare kan blicka in i nanomechanical värld av molekyler, såsom nukleinsyror, enzymer och proteiner motor som utför livsuppehållande arbete. Atomkraftsmikroskopi (AFM) är väl anpassad för att bestämma infödda strukturer av fibrösa proteiner med ett avstånd resolution om paritet med elektronmikroskopi. Men i AFM kraft studier krafterna är vanligtvis mycket högre än en enda molekyl kan uppleva 1, 2. Optisk fällor (OT) är väldigt bra på att bestämma det relativa avståndet mellan fångade pärlor och de kan ge mycket små styrkor 3. Däremot ger de inte exakt absoluta längden av molekyler under studien. Molekylär simuleringar ge stödjande information till sådana experiment, men är begränsade i förmågan att hantera samma stora molekylära storlekar, långa tidsramar, och övertyga vissa forskare i avsaknad av andra bevis 2, 4.

Gravitationskraften spektrometer (GFS) fyller en viktig nisch i den arsenal av en utredare genom att tillhandahålla en unik kombination av förmågor. Detta instrument kan generera krafter normalt med 98% eller bättre precision från femtonewton intervallet till nanonewton sortimentet. Avståndet Mätningarna är närvarande kan lösa det absolut molekylära längd ned till fem nanometer, och relativ pärla par sträckor separation med en precision som liknar en optisk fälla. Dessutom kan GFS avgöra stretching eller uncoiling där kraften är nära jämvikt eller ger ett graderat kraft att placera vid sidan mot varje uppmätt strukturella förändringar. Det är även möjligt att bestämma hur många aminosyror är inblandade i uncoiling händelser under fysiologiska kraft belastning 2. Till skillnad från andra metoder där det finns omfattande kraft kalibrering som måste föregå varje analys kräver GFS ingen sådan kraft kalibrering 5. Genom att komplettera styrkan av andra metoder, kommer GFS överbrygga luckor i förståelsen nanomekanik av vitala proteiner och andra makromolekyler.

Protocol

Introduktion till romanen GFS konfiguration

GFS består av flera viktiga delar: Ett vanligt ljusmikroskop, en ekvatorn fäste, en kamera och en dator [Figur 1]. Den förseglade flow-cell kammare som håller provet är också nödvändigt enligt GFS design. Den ljusmikroskop monteras på ekvatoriella montering så att omfattningen kan vridas i olika inriktningar i rymden. Denna förmåga gör att statisk vektor av gravitationen som ska exploateras så att proverna kan dynamiskt orienterade i förhållande till vektorn så att tyngdkraften kan ge piconewton-serien kraft laster med proverna. Kameran ersätter ljusmikroskop är okularlinsen så att den kan beräkna förändringar i inriktningen av provet. Detta rådata digitaliseras och manipuleras av datorn för att tolka data till faktiska kraft och mätningar avstånd. Den slutna flödet kammare är utformad så att alla grader av frihet i rymden utan prov förlust. I kammaren bor provet molekyl som är tjudrad nära ett terminalen till en "förankrad" pärla som limmas till ytan av kammaren. Motsatsen ändstationen är bundna till en "mobil" pärla som är fri från ytan av kammaren. Det är denna mobil pärla, gratis i analysen buffert som kan åtgärdas av gravitationskraften och därmed sträcker den tjudrade molekylen på så låg kraft laster [Figur 2]. Provet ser helt enkelt som ett par av mikrosfärer under lupp, även om det tar en viss erfarenhet att urskilja bra användbara par tillsammans med sin anslutning till en molekyl från par där båda kulorna sitter på ytan av flödet kammare. En ändring av systemet är tillägget av en flytande plattform som håller GFS och är upphängd i fjädrar. I den här konfigurationen när provet har roterats i en position där tyngdkraften kan agera på provet, kan plattformen och alla dess komponenter tas bort mot den fjäderkonstant. Nära fritt fall, är den kraft som verkar på den mobila pärla nära noll och vid källorna "maximal förlängning är den gravitationskraft multiplicerat med så mycket som två gånger. På detta sätt kan en graderad kraften / Avståndet svar ska plottas att mäta beteendet hos en enda molekyl med olika kraft laster.

1. Mikrosfär Förberedelser

  1. Sänk ca 10 mg av glas eller kvarts pärlor i 0,04% 3-Aminopropyltriethoxysilane (klipp med aceton) i två minuter.
  2. Skölj med två byten av dubbla destillerat vatten och centrifugera till pellets vid 2000 xgi 5 minuter. Kassera supernatanten.
  3. Tillsätt 5 ml koppling buffert (0,01 M pyridin skära med dubbla destillerat vatten och justera pH till 6,0), och skaka den här blandningen kraftigt. Centrifugera enligt ovan. Upprepa detta steg tre gånger.
  4. För vått block av pärlor, tillsätt 2 ml 5% gluteraldehyde lösning (skär gluteraldehyde med koppling buffert). Skaka kraftigt.
  5. Enligt en huva, rotera pärla / gluteraldehyde blandningen i 3 timmar vid rumstemperatur.
  6. Centrifugera enligt ovan och aspirera supernatanten.
  7. Tvätta pärlor i 5 ml koppling buffert genom att skaka dem kraftigt och centrifugera och aspirera supernatanten. Upprepa detta tre gånger.
  8. Tillsätt ca 15 mikroliter av önskad antikropp mot kulor och skaka kraftigt. Kulorna ska roteras i 16-24 timmar.
  9. Under huven, tillsätt 5 ml 1 M glycin härdning lösning (skär glycin med dubbla destillerat vatten och justera pH till 7,0). Skaka den här blandningen kraftigt och rotera i 30 minuter.
  10. Centrifugera och aspirera supernatanten.
  11. Tillsätt 5 ml tvättbuffert (0,01 M Tris, pH 7,0, 0,1% natriumazid, 0,1% BSA, 0,15 M NaCl och 0,001 M EDTA). Skaka den här kraftigt, centrifug och aspirera supernatanten. Upprepa detta steg ytterligare tre gånger.
  12. Byt buffert för låg salthalt buffert (0,1 M KCl, 0,02 M imidazol, 5 mM MgCl 2, justera till pH 7,0). Upprepa tre gånger.

2. Exempel Tillägg till Mikrosfärer

  1. Ta en liten mängd beredd kulor (ca 2 mikroliter från varje kaka av pärlor men om det finns en stor diskrepans i diameter mellan partier, är det fördelaktigt att använda runt en 08:01 förhållandet mellan stora till små pärlor) och lägga till dem ett mikrocentrifugrör med analysbuffert. Minska koncentrationen av ditt protein till cirka 5 mikroM, med hjälp av analys buffert. Bered minst en total volym på 400 mikroliter inklusive buffert, protein och pärlor.
  2. Rotera denna blandning på ca 1 varv i 3 timmar (om proteinet är upprörd för mycket, det kommer samman och blir oanvändbara).

3. Skjut avdelningen Förberedelser

  1. Coat en tjock objektsglas med 0,01% nitrocellulosa (i amylacetat). Låt denna bild torka i ca 10 minuter.
  2. Med ett vasst glas kniv, skär täcker bilden så att en kammare. Detta kräver fyra remsor av glas.
  3. Använd det faktumORY kanten av glaset och kratta det över ett utstryk av vakuum fett på båda sidor av gränsen.
  4. Tryck in fett belagda remsor på torkade nitrocellulosa omfattas bild för att skapa en ruta på ytan av bilden.
  5. Pipettera över 2 mikroliter av sträng / protein blandningen genom att knacka pipetter på ytan av glas inne i lådan.
  6. Tillsätt ca 20-400 mikroliter av låg salt-buffert beroende på hur stora kammaren.
  7. Tryck på ett täckglas ovanpå lådan som redan är täckt med vakuum fett för att avsluta det förseglade och buffrade kammare.
  8. Låt glida sitta på en jämn plats så pärlorna har gott om tid att förankra sig till nitrocellulosa.

4. GFS datainsamling

  1. Mount skjut på GFS scenen
  2. Övervaka vad GFS kameran spelar in och söka efter legitima "pärla par" där den lilla mikrosfär sitter nära ekvatorn av de stora mikrosfär.
  3. När en potentiell pärla par hittas, gå igenom skärpedjup för att avgöra om "mobil" pärla inte vilar på ytan av bilden.
  4. När en lämplig par identifieras, notera vinkeln mobil pärla från d max (d max = det maximala avståndet mellan centroids av det kopplade mikrosfärer). Flytta omfattningen i position att skaffa video.
  5. Vinkeln på resa i GFS bör vara tillräckligt för att spela in d min, d max, och d min som kan kräva 25-90 grader beroende på längden av molekylen.
  6. Rekord som paret reser från D min till d max och tillbaka till d min.
  7. Det är en bra idé att också skjuta en film i bakgrunden så att den kan dras senare för analys.
  8. Om du utför en GFS droppe, flytta omfattning tillbaka till d max och registrera droppe i minst 60 bilder per sekund. Den kritiska delen är den första svängning, men långa inspelningstider kan även användas för dynamisk studie.

5. GFS Data Analysis

  1. Förvandla rå video till digitalt "thresholded" bild och kör makrot i ImageJ för att bestämma centroiden positionen för varje pärla i varje bildruta. Detta är också för drop video.
  2. Dumpa X, Y och dataområdet från ImageJ till Excel och rita punkter.
  3. Om en riktig pärla par förvärvades av video är en märkbar puckel i diagrammet som tyder på kulorna vara i deras närmaste (d min) och vid spetsen av grafen är positionen för d max.
  4. Med hjälp av denna data bör radien för varje pärla bestämmas exakt i ImageJ och all denna information läggs i kapslade ekvation:
    d = [(g synd α) 2 + (g cos α + d max - g) 2] 0,5
    g = [d min 2 + r b 2 - (r a + r b) 2] 0,5 = r b synd β
    c = d max - r en - g
    (D = avståndet mellan centroids, g = gravitationen, α = vinkeln i grader parallellt med objektiv, r b = radie av mobila pärla, R a = radie av förankrade pärla, β = vinkel infästning av axel ekvatorn av förankrade pärla.
  5. Använda monterade radie mobila pärla som också ger dess volym och med tanke på tätheten av pärla, den kraft den mobila pärla skänker på molekylen kan beräknas på piconewtons efter flytkraft av lösningsmedlet dras. Denna metod mäter kraft den bundna molekylen i piconewtons och beräknar det absoluta molekylen längden mellan antikroppar bilagor i nanometer. F = V (db) en (F = kraft, V = volym, d = densitet av glaset mikrosfär, a = acceleration på grund av gravitationen, b = densitet fördrivna vatten).

6. Representativa resultat:

Om pärla prep görs korrekt, kommer det att finnas minst pärla aggregering även om det fortfarande kan vara en enstaka pärla klumpar. När sedd genom omfattning, bör det finnas en rimlig fördelning av pärlor om parade eller inte i kammaren.

Det är viktigt att minimera vibrationer så mycket som möjligt, för att göra detta antingen en luft-bord, speciella stötdämpande fot för ett stativ som håller en EQ montera, eller på system som använder fjädrar kan användas för vibrationsisolering.

Ett annat användbart tips om sluten flödet kammaren är att låta den stå i ungefär fem minuter på en jämn tabell efter att den har fullt utbyggt. Detta gör att eventuella lösa större pärlor att flyta ner genom bufferten och resten i lager av nitrocellulosa. Om bilden var istället monteras direkt efter avslutad, skulle utredaren har hela tiden ta itu med pärlor bokstavligen flyger genom synfältet, och om detta sker under videon förvärv kan det korrupta the försöket. Om detta görs på rätt sätt, är pärla flygningen betydligt minimeras och renare resultat video.

När en potentiell pärla par identifieras av GFS operatören, är det lämpligt att uttrycka det genom en inledande rotation för att övervaka beteendet hos paret. Sällan, är den stora pärlan inte är ordentligt fäst på bilden. Om detta händer, det är ingen idé med att utnyttja paret eftersom det är viktigt att de större förankrade pärla bo i ett fast läge genom varaktigheten av förvärvet. Om paret är stabilt och inte uppvisar "förankrade pärla rulla", då den är lämplig för experiment.

En tomt på pärla separationsavstånd kontra förändring i vinkel i förhållande till gravitationen kan användas för att utvärdera de förvärvade data. En bra representativt resultat skulle visa lite åtskilda på en platå och som den mobila pärla befriar sig från den förankrade pärla på grund av påverkan av gravitationen, kommer diagrammet visar mer separation. Detta fortsätter tills en fin topp nås som kallas d max och kurvan börjar nedåt igen tillbaka till utgångsläget d min [Figur 1]. Under idealiska förhållanden är denna signatur symmetrisk. En icke-representativt resultat skulle visa ett diagram med osammanhängande mönster visar inga tydliga d min-d max-d min mönster, eller det skulle visa separationer som är storleksordningar för höga för en enda molekyl visar kanske det var en bit av damm mellan kulorna, eller kanske att den mobila pärla helt enkelt inte var ansluten alls. Processen att hitta paret, skytte den bearbetning den och analysera den har många stopp luckor där felaktig pärla par gallras ut. Så om du kommer till slutet av hela processen och du har en molekyl längd som överensstämmer med tidigare resultat, kan man vara mycket säker på att den ursprungliga pärla paret är representativ och kan ingå i resultatet. På en bra dag kan ungefär hälften av pärla par skott tas genom att bli en legitim datapunkt. Till exempel är det snäckgång spole av myosin mellan MF20 och MF30 antikroppar, känd baserad på EM data och AFM, uppgifter att närma sig 100 nm 2,7,8,9. Om resultatet är flera gånger så lång, har provet aggregeras. De resultat som presenteras här är från standard GFS rotation experiment och visa ett avstånd av 96 nm ± 5 nm [Figur 2] som överensstämmer nära med mätningar av MF30 (som binder till N-terminalen av myosin subfragment-2) och MF20 (som binder mot bakgrund meromyosin) antikroppar avstånd på myosin härledas från litteraturen värden [Figur 3].

Figur 1
Figur 1. GFS konfiguration. Stora delar av GFS är märkta.

Figur 2
Figur 2. Schematisk i GFS princip. Vänster sida visar tyngdpunkt mobil pärla på ett minsta avstånd från tyngdpunkt förankrade pärla. Som GFS roteras, justerar mobil pärla med vektor tyngdpunkt som också körs parallellt med axeln i uppbundna molekylen. I detta läge är avståndet mellan centroids av mobil-och förankrade pärlor högst. Överst till höger visar en representativ skiva från en GFS film. Nere till höger är en bild av den offentliga sektorns finanser som genomgår rotation.

Figur 3
Figur 3 representativt resultat visar d min till vänster i diagrammet,. D max vid en relativ separation av 17,78 mikrometer, och en återgång till d min runt baslinjen ca 17,75 mikrometer av relativa avståndet mellan pärlorna.

Figur 4
Figur 4. Representant resultat av GFS rotation experiment som visar avståndet mellan MF20 och MF30 antikroppar genomsnitt 96 nm. Detta är den ungefärliga längden på S2.

Figur 5
Figur 5. Myosin II dimer används för att visa eventuella bilagor för användning tillsammans med GFS, inklusive antikroppar och / eller bilagor aktin. Olika fastsättning möjligheter tillåter olika GFS strategier för att mäta olika regioner, eller att tillämpa våld vinkelrätt eller parallellt med staven domän myosin dimer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

När du konverterar en film till ett digitalt thresholded representation, är det avgörande för thresholded bilden för att bibehålla samma område i varje bildruta. Eftersom pärlor i en pärla par rör sig oberoende av varandra, kan varje förändring i thresholded områden också orsaka de relativa avstånden mellan centroids av pärlor att driva och införa väsentliga fel. Styra tröskeln området minskat fel fem gånger i fjärran mätningarna från 26 nm ner till 5 nm. Det är också viktigt att få en exakt radie mätning för både pärlor som kvoten mellan pärlorna är viktigt att den slutliga beräkningen som ger både distans och värderingar kraft.

Systemet kan modifieras på många sätt. Det senaste systemet förmedlar graderade kraft till uppbundna molekylen genom att släppa hela GFS mot en fjäderkonstant. När fjäderkonstanten bestäms, kan en tredje-person-video kan erhållas på samma gång det mikroskopet videon är tagen och de två är synkroniseras tillsammans. Då varje bildruta av video från mikroskopkamera kan ges en kraft värde enligt position GFS som tappas i tredje-person, synkroniseras film. Varje bildruta har en motsvarande kraft värde som den mobila pärla är att förmedla under hösten och efterföljande retur av våren systemet. Varje bildruta är också analyseras för att få den absoluta molekylen längd. På detta sätt kan varje diskret kraften korrelerad till de separata avståndsmätning, alltså en graderad kraft / sträcka kurvan är tillgänglig att se hur en molekyl uppför sig under ökande belastning. Denna teknik bidrar också till att multiplicera den kraft en mikrosfär kan ge upp till två gånger tyngdkraften. Likaså är volymen av kornet vad som i slutändan bestämmer kraft profil som systemet är konstruerat för att släppas från samma avstånd varje gång. Däremot rotationen experimentera alltid bara ger en kraft värde. Ytterligare tillbehör är också möjligt att exempelvis genomblödning celler, fluorescens, ökad automatisering, eller till och med optiska fällor. Eftersom en betydande del av grundsystemet är dess låga kostnader och robusthet, kan systemet användas för enstaka demonstrationer molekyl test på pedagogiska laboratorier.

Ansökningarna för detta system har redan visat sig användbara för att bestämma den strukturella karaktären av den ihoprullade spole av myosin som beskrivs i representativa resultat. Dessutom bekräftas det också längder på 12 bp DNA jämfört med AFM data och visat tillförlitliga resultat om bristning kraft den dubbla strandsatta nukleotid 10. På grund av den flexibilitet som med hjälp av platsspecifika antikropp bilagor eller andra ligander eller till och med gifter, är GFS redo att generera mycket vetenskapliga strukturella data på nanonivå av struktur och picoscale av krafter. Molekyler kan mätas, sträcks och retade isär beroende på analysen. Molekyler redan kraft i systemet kan utsättas för reagens för att bestämma möjliga signalöverföring eller enzymatisk aktivitet. Möjligheterna till enda molekyl studier verkar oändliga vid denna tidpunkt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation i Grant nr 0.842.736.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Aminopropyltriethoxysilane Polysciences, Inc. 919-30-2
Acetone Fisher Scientific A18P-4
Pyridine Sigma-Aldrich 110-86-1
Glutaraldehyde Fisher Scientific G7776
Glycine Research Organics BP381-1
Tris Sigma-Aldrich 9682T
Sodium azide Amresco 71289
BSA Sigma-Aldrich AMR-0332-100G
NaCl Sigma-Aldrich S7653
EDTA MSI E9884
Nitrocellulose Sigma-Aldrich 60443
N-N Dimethyl Formamide Extracted from Large New D4254
Rabbit skeletal myosin II Zealand White Rabbits (7-8) NA
MF30 antibody (9-10) Developmental Studies Hybridoma Bank MF30
MF20 antibody (6) Hybridoma Bank MF20
Lab microscope Boreal WW57905M00
Equatorial mount Celestron CG-5
Digital video cam Sony Corporation XCDV60
Caliper release Cabelas IA-415482
Compression spring Jones Spring Co. 723
Extension spring Jones Spring Co. 770
ImageJ National Institutes of Health NA
Fire-i drivers & application Unibrain 3.80
Excel Microsoft NA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
  2. Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin. Biophysical Journal. 90, 2852-2866 (2006).
  3. Nishizaka, T., Miyata, H., Yoshikawa, H., Ishiwata, S., Kinosita, K. Unbinding force of a single motor molecule of muscle measured using optical tweezers. Nature. 377, 251-254 (1995).
  4. Gawalapu, R. K., Root, D. D. Fluorescence labeling and computational analysis of the strut of myosin's 50 kDa cleft. Arch. Biochem. Biophys. 456, 102-111 (2006).
  5. Kellermayer, M. S. Z. Visualizing and manipulating individual protein. Molecules Physiol. Meas. 26, R119-R153 (2005).
  6. Shimizu, T., Dennis, J. E., Masaki, T., Fischman, D. A. Axial arrangement of the myosin rod in vertebrate thick filaments: immunoelectron microscopy with a monoclonal antibody to light meromyosin. J. Cell Biol. 101, 1115-1123 (1985).
  7. Godfrey, J. E., Harrington, W. F. Self-association in the myosin system at high ionic strength. I. Sensitivity of the interaction to pH and ionic environment. Biochemistry. 9, 886-893 (1970).
  8. Root, D. D., Stewart, S., Xu, J. Dynamic docking of myosin and actin observed with resonance energy transfer. Biochemistry. 41, 1786-1794 (2002).
  9. Xu, J., Root, D. D. Conformational Selection during Weak Binding at the Actin and Myosin Interface. Biophys. J. 79, 1498-1510 (2000).
  10. Sattin, B. D., Pelling, A. E., Goh, M. C. DNA base pair resolution by single molecule force spectroscopy. Nucleic Acids Res. 32, 4876-4883 (2004).

Tags

Biofysik 49 Force Spektroskopi enda molekyl analyser myosin antikroppar digital bildbehandling Mikroskopi utbildning mikrosfärer spiral Coil Protein
Demonstrera användning av Novel gravitationskraften Spektrometer att stretcha och Mät Fibrer Proteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dunn, J. W., Root, D. D.More

Dunn, J. W., Root, D. D. Demonstrating the Uses of the Novel Gravitational Force Spectrometer to Stretch and Measure Fibrous Proteins. J. Vis. Exp. (49), e2624, doi:10.3791/2624 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter